Тыгиш рыбалка: Озеро Тыгиш — рыбалка, отдых, катание на катерах г. Каменск-Уральский

• «Ароматная» рыба с феромонами Покрывает друга рыбьими феромонами, увеличивая их рыбную ловлю на 100 на 5 мин.
• Awesomefish Используйте на игрока, чтобы ослабить его с помощью «Отлично! Кто-то думает, что вы классный!»
• Grieferfish Используйте на игрока, чтобы ослабить его с помощью «Griefer. Oh dear».
• Tyfish Используйте на игрока, чтобы ослабить его с помощью «Спасибо! Ты сделал для кого-то хороший подарок :)»

Лично я сомневаюсь, что буду широко использовать Рыбу-феромон, поскольку ее можно использовать только на других игроках. Я не совсем асоциальный геймер, но когда я ловлю рыбу, мне нравится одиночество. Если кто-то врывается на мою территорию, я беру и ухожу так быстро, как могу. Как мне смотреть Netflix во время рыбалки, если я не знаю, какой поплавок плещется на заднем плане? Меня также интересует реальная ценность рыбы-грифера.Я подозреваю, что настоящие гриферы примут дебафф как знак чести, в то время как невиновные игроки будут чувствовать себя несправедливыми, если их ударили им из-за смеха. Хотя я могу отстать от Awesomefish и Tyfish.

Все продукты, рекомендованные Engadget, выбираются нашей редакционной группой, независимо от нашей материнской компании. Некоторые из наших историй содержат партнерские ссылки. Если вы покупаете что-то по одной из этих ссылок, мы можем получать партнерскую комиссию.

(PDF) Тенденции созревания, свидетельствующие о быстрой эволюции, предшествовали краху северной трески

5

различных единиц.Халданы выражают скорость эволюции относительно продолжительности поколения и фенотипическое стандартное отклонение

рассматриваемой популяции, тогда как дарвины просто

описывают «грубую» скорость эволюционных изменений (см. Методы). Расчетные скорости составляют

: –13 600 (95% доверительный интервал: –19 100, –8 320) дарвинов и –1,20 (–1,74,

–0,63) галданов в Подразделении 2J; –18 810 (–24 410, –14 660) дарвинов и –1,50 (–1,93,

–1,20) галданов в Дивизионе 3K; –7 150 (–14 270, –670) дарвинов и –0.63 (-1,69,

0,26) галданов в Подразделе 3L. Оценки в дарвинах высоки, но сопоставимы с оценками

из других исследований, охватывающих аналогичную временную шкалу

22,23

. Напротив, оценки для

галданов выше, чем большинство ранее опубликованных показателей

22-24

. Это, однако, вероятно,

объясняется оценками галданов, нормализованными относительно фенотипа признака

стандартное отклонение

23

: поскольку средние точки нормы реакции оцениваются путем удаления из данных опосредованных ростом —

вариаций окружающей среды, соответствующие отклонения фенотипического стандарта

соответственно уменьшаются, и результирующие оценки для галданов равны

, следовательно, должны систематически превышать таковые для других количественных признаков, чувствительных к изменению окружающей среды

.

Эмпирические свидетельства в поддержку современной эволюции природных

популяций

25

. Было показано, что лов хариуса (Thymallus thymallus) в норвежских горных озерах

вызывает эволюционные изменения в созревании хариуса, сравнимые с

, которые мы наблюдали для северной трески

22

. На Галапагосских островах масса тела и размер клюва

зябликов Дарвина (Geospiza fortis) эволюционировали в течение одного поколения в

в ответ на изменение режима естественной смертности

26

.Полевые эксперименты с небольшой пресноводной рыбой (

), гуппи (Poecilia reticulata), документально подтвердили быструю эволюцию

жизненных черт в ответ на изменение режимов естественной смертности

11

.

Мы предполагаем, что применяемый здесь подход «норма реакции» может помочь менеджерам рыболовства

, подавая предупреждающие сигналы об изменениях в жизненном цикле, которые могут быть вызваны интенсивной эксплуатацией

. Чтобы подтвердить это утверждение, мы рассчитали нормы реакции и

Идентификация регуляторных элементов, воспроизводящих раннюю экспрессию. L-пластина в обволакивающем слое рыбок данио и эмбриональном перидерма

Abstract

Мы клонировали и охарактеризовали интронный фрагмент рыбок данио. цитозольный белок лимфоцитов 1 ( lcp1 , также называемый L-пластином) это приводит к выражению обволакивающего слоя рыбок данио (EVL).L-пластин — это кальций-зависимый связывающий актин белок, принадлежащий к семейству пластина / фимбрина белков, и необходим для правильной миграции и прикрепления нескольких типы взрослых клеток, включая лейкоциты и остеокласты. Однако у рыбок данио lcp1 обильно экспрессируется значительно раньше, во время дифференциация ЭВЛ. Клетки этого эпителиального слоя мигрируют вместе, растительно растекаясь по желтку. Экспрессия L-пластина сохраняется в перидерму личинки, временную эпителиальную ткань, которая формирует первую личиночная кожа.Это открытие устанавливает, что L-пластин активируется двумя способами. различные эмбриональные волны с четким регуляторным переключением между ранними ЭВЛ и более поздний лейкоцит. Чтобы лучше изучить клетки, экспрессирующие L-пластин, мы предпринята попытка рекомбинации, управляемой гомологией CRISPR / Cas9 (HDR), для вставки саморасщепляющийся пептид (Cre-P2A-EGFP-CAAX) ниже нативного промотор lcp1 . Это дало стабильную линию рыбок данио. экспрессия рекомбиназы Cre в ядрах EVL и зеленая флуоресценция в клетке EVL мембраны. Предоставлено отслеживание этих меченых клеток in vivo улучшенные представления о миграционном поведении EVL, расширениях мембран и митотических События. Наконец, мы экспериментально проанализировали ключевые элементы целевой Локус lcp1 , обнаруживающий интронную последовательность длиной ~ 300 п.н. достаточно, чтобы управлять выражением EVL. lcp1: Cre-P2A-EGFP-CAAX данио должен быть полезен для изучения спецификации обволакивающего слоя, движения гаструляции и развитие перидермы у этого широко используемого позвоночного модель.Кроме того, выделенные нами консервативные регуляторные последовательности предсказывают что ортологи L-пластина могут иметь сходный ранний паттерн экспрессии в других эмбрионы позвоночных.

Ключевые слова: Актин, Cre-рекомбиназа, цитоскелет, энхансер, эпиболия, эпидермис, эпителий, филоподии, гаструляция, ламеллиподии, микрориджи, перидерм, промотор

1. Введение

Основным белком цитоскелета, который в большинстве клеток является актин, является актин. существует в обоих мономерная и полимерная форма.После полимеризации образующиеся актиновые филаменты становятся организованные в параллельные пучки и разветвленные сети многочисленными аксессуарами белки. Большинство белков, организующих актин, встречаются повсеместно и встречаются во всех эукариотических организмах. клетки. Однако некоторые из них заметно зависят от происхождения, что вызывает вопрос о какие уникальные функции обеспечивают эти белки и как контролируется их экспрессия. В сочетании как универсальные, так и специализированные организаторы актина увеличивают возможности цитоскелета, расширение клеточного репертуара.

В этой статье мы представляем наши недавние исследования клеточно-специфических связывающий актин белок, называемый цитозольным белком лимфоцитов 1 ( lcp1 ). Это высококонсервативный кальций-зависимый фосфопротеин в семействе белков фимбринов (Галкин и др., 2008; Zhang et al., 2016). Первоначально выделенный из неопластических фибробластов человека, он был назван «p65». для его молекулярной массы 65 кДа (Goldstein et al., 1985; Lin et al., 1988). Потом, тот же белок был идентифицирован как высокоэкспрессируемый в активированных макрофагах мыши, приводит к названию «лейкоцит-специфический пластин» или «L-пластин» (Shinomiya et al., 1994). Текущие исследования L-пластина идут по двум хорошо проторенным дорогам: роль в нормальных клетках и его роль в опухолевых клетках. В нормальном контексте L-пластин характерно для В-клеток, Т-клеток, макрофагов, моноцитов, естественных клеток-киллеров, и нейтрофилы (обзоры Delanote et al., 2005; Морли, 2012). В этих клеток, L-пластин необходим для нескольких важных функций, включая созревание, миграция и формирование иммунных синапсов (Wang et al., 2010; Тодд и др. 2011, 2016; Deady et др., 2014; Чжоу и др., 2016). L-пластин также экспрессируется в остеокластах, где он необходим для клеток-субстратов. контакт и, следовательно, резорбция кости (Ma et al., 2010; Chellaiah et al., 2018). Иммунные клетки и остеокласты похожи в том, что они блуждающие клетки, которые должны устанавливать высокоаффинные контакты с конкретными внеклеточными мишенями. Таким образом, они, вероятно, требуют усиленного связывания актина для стабилизации проекций клеточных мембран, используемых в направленная миграция или адгезия к субстрату.

Повышенная миграция является признаком рака, и большинство случаев смерти от рака являются результатом от клеточного распространения первичной опухоли.Таким образом, L-пластин имеет дополнительное значение. из-за его широко распространенной экспрессии в раковых клетках множественного происхождения. У животных модели, сверхэкспрессия L-пластина способствует устойчивости к апоптозу, матрикс инвазия и метастатическое распространение (Janji et al., 2010), тогда как подавление siRNA имеет противоположный эффект (Chaijan et al., 2014; Inaguma et al., 2015). У людей L-пластин был предложен как диагностический или прогностический маркер рака толстой кишки, почек, носоглотки и полости рта (Klemke et al., 2007; Samstag, Klemke, 2007; Li et al., 2010; Ли и Чжао, 2011), и значение такого выражения является предметом периодических обзоры (Самстаг, Клемке, 2007; Шиномия, 2012). Вопрос все еще не решен из открытия L-пластина 30 лет назад — это то, как тот же ген регулируется быть определяющим в выбранных линиях передачи, где это полезно, но одновременно подавлен во всех остальных клетках. Следовательно, регуляторный контроль L-пластина также представляет интерес и будет способствовать изучению как нормальных, так и раковых клеток.

Здесь мы показываем, что L-пластин не ограничивается лейкоцитами рыбок данио, но имеет дополнительный главный домен экспрессии во время раннего эмбрионального развития.В соответствии с сообщенной экспрессией мРНК, белок L-пластин сначала обнаруживается на поздняя бластула. Пространственно выражение ограничено охватывающим слоем (EVL), экстраэмбриональная ткань с эпителиальными характеристиками. Временно выражение совпадает с дифференцировкой и миграцией EVL, когда клетки быстро мигрируют через желток. Слабое выражение перидермы сохраняется до стадии хвостовой почки, но быстро исчезает; к 24 часам экспрессия ограничивается отдельными блуждающими миелоидными клетками. Эти наблюдения показывают, что L-пластин рыбок данио активируется двумя эмбриональными волнами, с четким регуляторным переключением между ранним, EVL и последующим лейкоциты.

Чтобы лучше изучить клетки, экспрессирующие L-пластин, мы создали новый стабильный трансгенные рыбки данио — Tg ( lcp1 : Cre-P2A-EGFP-CAAX) — содержащие многофункциональная белковая кассета, расположенная ниже 990 п.н. lcp1 интроника фрагмент. Эта кассета управляет локализованной в ядре рекомбиназой Cre и мембранно-обогащенный EGFP во всех экспрессирующих L-пластин клетках. Эмбрионы F2 показывают менделевскую наследование трансгена, а также тройная экспрессия Cre, EGFP и L-пластин в ЭВЛ. Этикетка флуоресцентной мембраны обеспечивает отличную детализацию Миграционная активность EVL, выступы мембран и митотические события в vivo , что продемонстрировано с помощью покадровой конфокальной микроскопии.Чтобы изолировать последовательности, которые управляют ранней эмбриональной экспрессией у рыбок данио, мы проанализировали ключевые элементы целевого локуса lcp1 и протестировали серию промоторов конструирует in vivo . Это дало интронную последовательность размером ~ 300 п.н. Достаточно для управления экспрессией EVL и перидермы, но не может активировать лейкоциты выражение. Наш анализ in silico идентифицирует эту последовательность как альтернативный сайт начала транскрипции (TSS) в пределах lcp1 первый интрон, который активен только во время гаструляции и сегментации рыбок данио (18 ч. интервал).В целом, наша новая стабильная линия рыбок данио должна быть полезна для изучения спецификация обволакивающего слоя, движения гаструляции и развитие перидермы в это широко используемая модель позвоночных. Кроме того, регуляторные последовательности у нас выявлено, будет способствовать изучению того, как экспрессия L-пластина контролируется в специфические линии, такие как кожа, кости и иммунная система.

2. Результаты

2.1. Белок L-пластина экспрессируется в обволакивающем слое и эмбриональном слое. periderm

Когда началось наше исследование, мы знали, что мРНК L-пластина экспрессируется в ЭВЛ от поздней гаструляции до ранней стадии сомитов и при блуждании лейкоциты на более поздних стадиях (Thisse et al., 2001). Чтобы определить самые ранние клетки, в которых находится белок L-пластина. экспрессии, мы выполнили полную иммуногистохимию на эмбрионах дикого типа. Наше исследование началось на стадии 1-2 клеток — времени, когда L-пластин локализация не была хорошо описана — и заканчивалась на 2 dpf, когда лейкоциты выражение четко установлено. Все эмбрионы на стадии дробления были отрицательными (не показано), что приводит нас к выводу, что L-пластин рыбок данио не имеет материнского депонирован, и эта зиготическая экспрессия слабая или отсутствует до срединная бластула.

Как и ожидалось из предыдущих отчетов о локализации мРНК, антитело сигнал впервые появился на поздней бластуле. На этом этапе бластомеры способствуют три различных популяции: обволакивающий слой (EVL), глубокие клетки (DC) и ядра синцитиального слоя желтка (YSL; Bruce, 2016). По мере развития эпиболии EVL опережает DC и окружает желточный клубок в виде единого слоя плоских эпителиальных клеток, образующих внешнее покрытие зародыша. По 50% эпиболии обнаружен белок L-пластин. исключительно в ЭВЛ (и).Это выражение сохранялось через желток закрытие пробки и в эмбрионы на стадии сомита (и). Интересно, что LCP1 выражение в EVL неоднородно, но выглядит разнообразным, так что клетки светлее или темнее своих соседей (). Внутри каждой клетки флуоресцентные сигналы распределялись следующим образом: точки или сгустки по всей цитоплазме (). После стадии 15 сомитов мы наблюдали иммунореактивность в широком диапазоне области перидермы данио, хотя и с меньшей интенсивностью. По 1 dpf, экспрессия перидермы ослабла и сменилась интенсивными отдельными лейкоцитами. окрашивание (не показано).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии L-пластина у ранних рыбок данио разработка.

A. Экспрессия обволакивающего слоя (EVL) при 50% эпиболии, видно в экваториальном обзоре.

B. Экспрессия EVL при 50% эпиболии, вид в разрезе единая фокальная плоскость. Плоский ЭВЛ сильно окрашен, в отличие от глубокие клетки (DC) и синцитиальный слой желтка (YSL).

C. Экспрессия EVL на 90% эпиболии, видна под углом от растительный полюс.

D. Экспрессия перидермы на стадии сомита. Интенсивность пятна пестрый, в соседних клетках он проявляется ярче или темнее.

E. 70% эпиболия, промежуточное увеличение шапки животного ЭВЛ.

F. 70% эпиболия, высокое увеличение EVL. В в этой единственной фокальной плоскости, экспрессия L-пластина выглядит как плотно упакованная цитоплазматические точки или скопления.

DC = глубокие ячейки; ЭВЛ = обволакивающий слой; YSL = синцитиальный слой желтка.

Эти наблюдения подтверждают модель, в которой белок L-пластина не депонируется по материнской линии, и экспрессия активируется на поздней стадии бластулы. После дифференциация клонов бластомеров на EVL, DC и YSL, L-пластин представляет собой высокоспецифичный маркер EVL и его непосредственного производного, эмбрионального перидерма.

2.2. Создание и проверка стабильного трансгенного репортера L-пластина линия

Исходя из нашей предыдущей работы, мы знали, что рыба, несущая одну или две Нулевые аллели L-пластина (lcp1 ^+/- и lcp1 ^{— / —} ) были жизнеспособными и плодородными (Келл и др., 2018). Это позволило нам для планирования эксперимента по рекомбинации на основе гомологии (HDR), в котором одна копия L-пластин будет заменен инженерной конструкцией после родной промоутер.

Мы впервые разработали направляющую РНК CRISPR для нацеливания на первый кодирующий экзон. (;). Этот реагент оказался высокоэффективным, образование инделей у> 95% инъецированных эмбрионов (и). Затем мы подготовили трансгенную кассету для вставки. Ключевые особенности этого кассеты были 1) оптимизированной последовательностью Козака, окружающей начало трансляции сайт, 2) единственная открытая рамка считывания, содержащая как рекомбиназу Cre, так и нацеленный на мембрану зеленый флуоресцентный белок (EGFP-CAAX), и 3) два ~ 1 кБ рукава гомологии, фланкирующие экзон-мишень ().Подробное описание характеристик и сборки кассеты. процедуры, см. Методы. Наконец, кассета ДНК была объединена с проверенной направляющей РНК и очищенным белком Cas9 для вызвать HDR ().

Целевая модификация L-пластина рыбок данио.

A. План для направляющей РНК (синий), нацеленной на первое кодирование экзон lcp1 . Прогнозируемый двухцепочечный разрыв CRISPR / Cas9 (красный треугольник) прерывает сайт рестрикции Hpy188I (желтый). PAM = protospacer смежный мотив.Руководство по последовательностям РНК и праймеров для генотипирования см. В разделе.

B. Схема рестрикции Hpy188I дикого типа. Немодифицированный ампликон выглядит как дублет.

C. Высокоэффективная INDEL-активность в целевом сайте гРНК. По сравнению с неинъектированным контролем, у 100% инъецированных эмбрионов наблюдается верхняя непереваренная полоса (белая стрелка), указывающая на потерю целевого Hpy188I сайт ограничения.

D. Конструирование трансгенной кассеты, нацеленной на первый кодирующий экзон lcp1 .Кассета имеет оптимизированный Последовательность Козака (желтая), за которой следует саморасщепляющийся пептид Cre-рекомбиназа / P2A (красный), нацеленный на мембрану EGFP-CAAX (зеленый) и полиА SV40 (оранжевый).

E. Открытая рамка считывания кассеты по бокам ~ 1kB 5 ’и 3’ плеч гомологии (синие), включающие хромосомные последовательности, изогенные популяции инъецированных рыб. Подробнее о сборке см. Методы 4.3.

F. Запланированная рекомбинация, управляемая гомологией (HDR), при которой трансгенная кассета замещает первый кодирующий экзон lcp1 .После рекомбинации модифицированные клетки будут иметь один аллель, кодирующий полноразмерный L-пластин и один аллель, кодирующий вставленный трансген.

Таблица 1

Ключевые олигонуклеотиды и праймеры для нокаутирующей конструкции.

Через три месяца после введения этой смеси нескольким сотням животных дикого типа эмбрионов, мы скрестили выживших рыб F0 для скрининга на передачу по зародышевой линии. Используя эпифлуоресцентную микроскопию при 70% эпиболии, мы подтвердили интенсивный EGFP + EVL клетки в потомстве от одной самки.Примерно 20 из этих трансгенных Затем эмбрионы выращивали до зрелого возраста, производя F1. Хотя все особи F1 показали ожидаемую передачу 50%, два мужчины-основателя обеспечили наибольшую интенсивность сигнала. Этих самцов еженедельно спаривали с самками дикого типа, и мы использовали свое потомство F2 для анализа трансгенных сигналов в vivo .

2.3. Эмбрионы Tg (lcp1: Cre-P2A-EGFP-CAAX) повторяют ранний L-пластин экспрессия

В соответствии с экспрессией белка нашего целевого гена () трансгенные эмбрионы сначала показали слабую флуоресцентные клетки EVL при 30% эпиболии ().В следующие 4–6 ч этот сигнал усилился, высвечивает вегетативную миграцию EVL над желтком (и Movie S1). Полнослойный конфокальный стеки подтвердили, что клетки EGFP + были ограничены одним слоем (), тогда как глубокие клетки, YSL и масса желтка была отрицательной для активации трансгена.

Трансгенная экспрессия в lcp1 : EGFP-CAAX эмбрионах.

A. 30% эпиболи, трансгенный эмбрион в экваториальной проекции. В EVL показывает слабую, разнообразную экспрессию EGFP.

B. 70% эпиболи, трансгенный эмбрион в экваториальной проекции. Сигнал усиливается по мере того, как EVL распространяется по желтку.

C. 70% эпиболия, вид в разрезе единственной фокальной плоскости. Только Клетки EVL представляют собой EGFP +, в отличие от глубоких клеток (DC) и синцитиальных клеток желтка. слой (YSL).

D. Живой эмбрион на стадии 15 сомитов. lcp1: EGFP-CAAX маркирует перидерму, самый внешний эпителиальный слой.

E. Увеличение задней почки в D, показывая пестрые EGFP в соседних перидермальных клетках.

F. Фиксированный эмбрион на 1 dpf, с фаллоидином-568 контрастное пятно. Участок перидермальных клеток, удерживающих метку (зеленый), лежит поверх развивающаяся мускулатура туловища (красная).

Дополнительные данные к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://doi.org/10.1016/j.gep.2019.03.001.

После закрытия желточной пробки ЭВЛ прекращает миграцию и дифференцируется в место, образующее зародышевую перидерму (). Хотя каждая перидермальная клетка оставалась флуоресцентной для некоторых степени интенсивность варьировалась от ячейки к ячейке ().По сомитовой стадии (~ 24 hpf) широко распространены перидермальная метка значительно уменьшилась. На его месте наблюдались региональные маркировка небольших групп ячеек, часто кластерами или рядами. Хотя это сигнал был переменным от эмбриона к эмбриону, повторным взятием образцов мы смогли документировать трансгенные эпителиальные клетки, покрывающие почти все области тела, включая роговицу, перикард, хвостовую почку и туловище (). Эти удерживающие метку клетки перидермы или LRPC, обеспечивающие четкие конфокальные изображения с четко определенными мембранными характеристиками, в том числе скопления EGFP в лабиринтных апикальных микрориджеях, типичных для Эпидермис рыбок данио (Bereiter-Hahn et al., 1979; Uehara et al., 1991; Пинто и др., 2018). Разбросанные LRPC оставались видимыми, хотя и реже, до середины глотки (~ 30 hpf). К 2 dpf сигналы EGFP не обнаруживались (не показаны).

Чтобы убедиться, что трансгенные клетки EGFP + в этих эмбрионах также экспрессированный эндогенный L-пластин, мы иммуноокрашивали несколько сотен F2 гаструл с ранее использованным первичным антителом (LCP1 против рыбок данио). Эта процедура дали эквивалентные наборы клеток EGFP + и LCP1 + (). Как и ожидалось, трансгенный сигнал был самым ярким в EVL. плазматическая мембрана, соответствующая флуорофору, меченному CAAX, в то время как сигнал антител был самым ярким в цитоплазме EVL, что соответствует Цитоскелетная роль L-пластина.

lcp1 : EGFP-CAAX и эндогенный белок LCP1 метят совместно EVL у трансгенных эмбрионов.

A. Z-проекция, показывающая сигналы EGFP в ячейках EVL lcp1 : гаструлирующий эмбрион EGFP-CAAX. Сигналы самые сильные в мембране, с рассеянными очагами в цитоплазматических пузырьках и околоядерных Гольджи.

B. Наклонная стопка того же объема, что и (A), показывает EGFP в EVL, но не в нижележащих глубоких клетках (DC).

С, Д. Красный канал просмотров того же объема, показывающий Иммуноокрашивание целиком с L-пластином против рыбок данио. Интенсивность пятен составляет пестрый, но ограничивается ЭВЛ.

E. Объединенное изображение A и C.

F. Объединенное изображение B и D. Как и ожидалось, две метки в разных компартментах: трансгенный EGFP-CAAX выделяет мембрану EVL, в то время как эндогенный L-пластин (связывающий актин белок) заполняет цитоплазму EVL. Ни один из сигналов не появляется в глубоких клетках.

В целом эти наблюдения показывают, что наша новая трансгенная линия резюмирует ожидаемый ранний паттерн экспрессии белка L-пластина в прозрачный зародыш данио. Флуоресцентная этикетка обеспечивает эффективную живую визуализация EVL и клеток перидермы до средней стадии глотки.

2.4. Покадровое наблюдение за мембранно-меченым EVL документирует базо-латеральный трепетание, радиальная протрузия и наследственные уровни EGFP интенсивность

Создавая нашу конструкцию с EGFP с меткой CAAX, мы хотели нарисовать внимание к миграционной и протрузивной активности L-пластина, экспрессирующего клетки.Чтобы задокументировать эту активность в EVL во время эпиболии, мы собрали время покадровые изображения трансгенных эмбрионов до 18 ч in vivo . В В следующем описании мы суммируем наши наблюдения за боковыми выступами активность, радиальная протрузивная активность и митотические события в клетках EVL.

2.4.1. Боковая и радиальная выступающая активность

EVL имеет четкое анатомическое положение, клеточную морфологию и цитоскелетные специализации (Ho, 1992; Брюс, 2016). Фенотипически он напоминает простой плоский эпителий.Однако базальный пластинка отсутствует, что означает, что клетки EVL ползают прямо по нижележащей глубокие клетки. Соседние клетки EVL соединены латерально апикально плотно сочленений (Kiener et al., 2008; Fukazawa et al., 2010) и их периферическая цитоплазма обогащена нитчатым актином (Zalik et al., 1999; Cheng et al., 2004). Напротив, лежащие в основе глубокие клетки морфологически округлены, слабо связаны и не имеют плотной Периметр F-актина. В совокупности эти особенности позволяют назначать бластомеры либо к EVL, либо к DC довольно однозначно.

Без прикрепленной пластинки базальные мембраны ЭВЛ могут быть довольно вольный. Выступы, которые проходят под соседними ячейками EVL были зарегистрированы на фиксированных эмбрионах с использованием меченого фаллоидина (Zalik et al., 1999) и передачи электронная микроскопия (Сланчев и др., 2009 г.). Однако, насколько нам известно, эти структуры не были исследованы на живых эмбрионах. Поэтому мы воспользовались нашим мембранно-усиленные трансгены для записи протрузивного поведения EVL на обоих шапочка животного и экваториальный край гаструлирующих эмбрионов от 50% до 70% эпиболия.Последовательность интервальной съемки (30–40 мин) показала, что локальная мембрана расширения были чрезвычайно динамичными, как в поперечном направлении, так и в удлинении скорость (& Movie S2). Индивидуальная мембрана формы сильно различались, переходя между пластинчатыми и филоподиальными формами. В некоторых случаях мы видели, как дистальные мембраны отламываются от собственно клетки, образуя один или несколько короткоживущих пузырьков. Помимо апикального Z-проекции, показывающие латеральную протяженность мембран EVL, мы использовали 4D рендеринг для просмотра данных наших временных рядов из базового, а не из апикальная поверхность.Раскрашивая эти изображения по глубине, мы определили многочисленные радиально направленные выступы, многократно прощупывающие подлежащие глубокие клетки (& Movie S3).

Боковая протрузивная активность, радиальная протрузивная активность и митотическая активность события в lcp1 : EGFP-CAAX EVL клетках.

A. Покадровая визуализация боковой протрузии EVL (Фильм S2). В вид на шапку животного, и несколько выступов мембраны имеют ложный цвет зеленый. Яркая клетка EVL расширяет ла-меллиподиальную проекцию (белая стрелка) под ядро соседней темной клетки.Затем проекция разбивается на более мелкие филоподы и пузырьки.

B. Покадровая съемка радиальной протрузии ЭВЛ (Фильм S3). В конфокальный объем был сегментирован для удаления глубокого клеточного слоя, инвертированного в показать мембраны EVL, расширяющиеся вверх, и перекрашивать их с помощью автоматизированного схема кодирования глубины. Синие воксели = апикальный край; красные воксели = базальный крайний. Радиальные выступы выглядят как желто-красные шипы (белые стрелки), которые расширяются и отступать каждые несколько минут.

C. Покадровая визуализация митоза EVL. Делящаяся клетка ложно-зеленый. Уровни экспрессии EGFP варьируются от клетки к клетке, но они стабильна на протяжении всего клеточного цикла. Когда возникают митозы, дочери наследуют родительский сигнал. Отметка времени для всех панелей = минуты: секунды.

Дополнительные данные к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://doi.org/10.1016/j.gep.2019.03.001.

2.4.2. Интенсивность EGFP сохраняется в течение клеточного цикла

Необычная особенность мРНК, белка и трансгена L-пластина экспрессия представляет собой пространственно-изменчивую интенсивность в соседних клетках EVL.Хотя изначально мы думали, что эти вариации интенсивности могут быть краткосрочная и кратковременная покадровая визуализация показала, что одноклеточная Интенсивность флуоресценции была чрезвычайно устойчивой, сохранялась до 8 ч. in vivo . Делящиеся клетки EVL, хотя и редко, были замечены. легко из-за заметной концентрации EGFP в перинуклеарном Гольджи, и перестройка этой органеллы в разные фазы клетки цикл (). Интересно, что эти митотические события всегда производили дочерей с одинаковыми уровнями EGFP, похожими в родительскую ячейку.

2,5. Трансгенные эмбрионы экспрессируют активный Cre в клетках EVL, что позволяет отслеживать клонирование изогенных групп

После проведенных выше экспериментов мы были уверены, что сконструированные lcp1 : EGFP-CAAX был эффективным визуальным маркером для Клетки, экспрессирующие L-пластин. Чтобы подтвердить, что lcp1 : Cre рекомбиназа также присутствовала, мы выполнили полную иммуногистохимию с анти-Cre антитела. Скрещивая F1 с дикими типами, мы получили 50:50 дикого типа: трансгенные клатчи и фиксировали их на нескольких этапах до 1 dpf.Начиная с 30% эпиболии мы обнаружили слабый ядерный Cre у 50% потомства, согласуется с менделевским наследованием трансгена. На 70% эпиболы это сигнал стал ярче, четко обозначая трансгенных братьев и сестер по сравнению с братьями и сестрами дикого типа (и). Как и ожидалось, сигналы EGFP и Cre совместно локализованы в EVL. и интенсивности коррелировали положительно (). Z-стеки с большим увеличением подтвердили сильную анти-Cre сигналы в больших уплощенных ядрах клеток EVL, а не в глубоких клетках, с маленькими округлыми ядрами ().

Экспрессия и активность рекомбиназы Cre в lcp1 (Cre-P2A-EGFP-CAAX) трансгенных эмбрионов.

A. Фиксированный трансгенный эмбрион на 80% эпиболии. Иммуногистохимическое мечение показывает устойчивый ядерный сигнал во всех клетках EVL. красный = моноклональное антитело против Cre, синий цвет = ядерное окрашивание DAPI.

B. Фиксированный родственный эмбрион дикого типа, совместно окрашенный образец в (А). Хотя подвергается воздействию тех же первичных и вторичных антител растворы, ядра не окрашиваются в красный цвет.

C. Фиксированный трансгенный эмбрион, шапочка животного на 80% эпиболии. Сигналы EGFP и Cre положительно коррелируют. Клетки с яркими мембранами имеют яркие ядра; клетки с тусклыми мембранами имеют тусклые ядра.

D. Изображение одиночного Cre-позитивного EVL с большим увеличением ядро (красный), лежащее на множестве Cre-отрицательных глубоких ядер клеток (синий).

E. In vivo подтверждение активности Cre. После переходного трансгенез с репортерной плазмидой Cre, живым кластером трансгенно меченые клетки перидермы (зеленые) экспрессируют рекомбинантный RFP-меченный мышиный CD8a (красный).Подробнее см. Методы.

После этих наблюдений в фиксированных тканях мы подтвердили активность Cre in vivo путем инъекции индивидуализированной конструкции экспрессии содержащая флоксовую стоп-кассету перед трансмембранным белком с красной меткой (мышь CD8a-TagRFP-T). TagRFP-T — медленно сворачивающийся мономерный красный флуорофор с отличная яркость и стабильность (Shaner et al. др., 2008). Чтобы улучшить сигнал, мы отложили сбор тканей. до стадии сегментации, позволяющей накапливать новые молекулы RFP.Используя это анализ мы наблюдали ярко-красные точки в кластерах или рядах EGFP + перидермальных клеток, что соответствует клональной экспансии из рекомбинированной родительской клетки (). В отличие от этого, RFP отсутствовал в как неинъектированные трансгены, так и инъецированные контроли дикого типа (не показаны).

Обобщая наши наблюдения, делаем вывод, что lcp1 : Трансгенная линия Cre-P2A-EGFP-CAAX точно воспроизводит белок L-пластина. экспрессия в течение первых 24 часов развития рыбок данио. Использование одного открытого рамку считывания, содержащую саморасщепляющийся пептид P2A, мы смогли экспрессировать два отдельных белка — мембранный EFP и ядерный Cre-во всех клеток EVL.В будущем исследований, эта комбинация должна быть полезна для визуализации, отслеживания и генетического модифицируют EVL и его производную по линии, эмбриональную перидерму.

2.6. Идентификация in silico эволюционно консервативного интронного элемента lcp1 со стадией специфической транскрипционной активации у рыбок данио

Наши эксперименты к настоящему времени подтвердили стабильное менделевское наследование и сильная экспрессия трансгенной конструкции в EVL и перидерме. тем не мение отсутствие флуоресцентной метки в лейкоцитах плюс невозможность обнаружения целенаправленные вставки в хромосому 9 с помощью ПЦР повысили вероятность того, что кассетный интеграция была не специфичной для последовательности, а случайной.Мы рассудили, что случайная вставка может повторять выражение EVL только в одном из двух состояний. Одно государство было бы, если бы интеграция произошла случайно, рядом с другим. EVL-активный локус. Другое состояние было бы, если бы сама конструкция содержала как кор-промотор, так и энхансер, специфичный для EVL, и могут действовать как «Мини-ген». Чтобы проверить гипотезу мини-гена, мы ввели несколько кладка эмбрионов дикого типа только с плазмидной ДНК, исключая направляющую РНК и Белок Cas9 (см. 4.3.4). В течение 6 часов мы наблюдали, что примерно 50% инъецированных эмбрионов имели флуоресцентный EVL клетки (не показаны).Имея окончательные доказательства активности эндогенного промотора, Затем мы проанализировали гомологичные плечи кассеты на предмет кандидатов в регуляторные регионы.

Ранее не проводилось исследований промотора L-пластина у рыбок данио, хотя несколько групп исследовали последовательности человека и мыши (Lin et al. 1993, 1997; Peng et al., 2001). Несмотря на высокую консервацию аминокислот среди этих видов белков (~ 82%), сравнивая их интрон-экзонную структуру сложнее. Первый интрон рыбок данио большой (> 13 кБ) и содержит более 67% повторяющихся элементов, преимущественно транспозонов ДНК.Человек а первые интроны мыши еще больше (> 20 кБ) и также повторяющийся. Как и следовало ожидать, эти интроны плохо выстраиваются, что затрудняет поиск. для общих функциональных областей.

Учитывая, что геномы других рыб могут обеспечивать лучшую структурную совпадают с исследуемой последовательностью рыбок данио, мы исследовали локус L-пластина в несколько других костистых. В частности, три вида — колюшка, плоская рыба, и amazon molly-общий первый интрон размером всего 4kB (). Мы пришли к выводу, что эти «минимальные интроны могут показать ключевые области регулятивной консервации.Используя эти 4 kB при множественном выравнивании (), мы идентифицировали четыре пика с> 50% сходства последовательностей (). Их назвали эволюционно консервативные области, или ECR. Примечательно, что четвертый ЭКР располагался на крайнем 3 ’конце интрона. Путем поиска в геноме рыбок данио с этим коротким консенсусным ECR мы обнаружили, что соответствующая область упала в пределах нашего ранее построенного плеча гомологии ~ 1 kB 5 ’.

Филогенетическое сравнение размера первого экзона lcp1 и открытие нескольких эволюционно-консервативных регионов (ECR).

A. Сравнительный размер lcp1 первый интрон в выбранных геномах позвоночных. 5’UT1 = фиолетовый; кодирование белков регионы = зеленый.

B. mVISTA выравнивание lcp1 первый интрон у молли, колюшки и плати-амазонки обнаруживает 4 эволюционно консервативные области (сходство> 50%), обозначенные от ECR1 до ECR4.

C. Сращенные EST показывают интронный «предгорье» (оранжевая стрелка) рядом с границей канонического экзона, что указывает на транскрипционная активность.Эти предгорные EST предназначены для конкретной сцены, чтобы защитить или стадия сегментации зародыша (см.).

D. Кластер CAGE-seq, активный между сферой и сомитом стадий предполагает регулируемый в процессе развития альтернативный старт транскрипции. site (TSS) примерно на 500 п.н. выше канонической границы экзона.

E&F. Активация модификаций гистонов (h4K4me3 и h4K27ac) перекрывают EST и кластер CAGE-seq. Эти онтогенетические отметки появляются только в узком специфическом для сцены окошке, от купола до щита. 5 ’ UTR = 5 ’нетранслируемая область; ECR = эволюционно консервативный регион; lcp1 = L-пластин.

Таблица 2

Понимая, что этот ECR был вероятным источником EVL-специфического промотора активности, мы искали дополнительную информацию как на генетическом, так и на эпигенетическом уровне. уровни. Потому что с момента создания нашего оригинального construct, мы смогли использовать новые общедоступные ресурсы в этой попытке. В частности, мы использовали трек-хаб DANIO-CODE (Tan et al., 2016), который аннотирует сборку рыбок данио GRCz10. с предсказанной и экспериментальной информацией о регуляции генов (июль 2018 г., данио-код.zfin.org) . В следующих разделах описываются четыре специфические аннотации-EST, CAGE-seq, модификации гистонов и RNA-seq- которые были наиболее информативными в нашем целевом регионе.

2.6.1. Метки экспрессируемой последовательности (EST)

EST представляют собой короткую последовательность кДНК, которая была картирована в геноме. (Богуски и др., 1993). Как таковой, они регистрируют транскрипционную активность в исследуемой ткани и стадии. EST могут быть классифицированы как сращенные или несращенные, а те, которые сращиваются, должны совпадают только экзоны.Таким образом, скопления склеенных EST документируют альтернативный экзоны, используемые в локусе. Внутри первого интрона рыбок данио мы обнаружили второстепенный пик сращенных EST (N = 4;). Хотя этот пик был незаметен по сравнению с EST. покрытия в соседнем экзоне, ожидание наблюдения четырех попаданий в random в окне <100 bp чрезвычайно мало - менее одного дюйма 10 ¹² (van Arensbergen et al., 2017). Из четырех представленных последовательностей три были из библиотека стадии щита, а одна — из библиотеки стадии сегментации ().Узкий онтогенетический диапазон этих EST, плюс экспериментально подтвержденная промоторная активность плечо 5’-гомологии lcp1 привело нас к выводу, что эта последовательность содержит альтернативный сайт старта транскрипции (TSS), активный только в начале эмбрион.

Таблица 3

Сплайсированные EST в 5 ’гомологическом плече.

2.6.2. Пики CAGE-seq и активирующие модификации гистонов

Cap-анализ экспрессии гена (CAGE) позволяет чувствительному идентификация стартовых сайтов транскрипции (Fort and Fish, 2017). Активные TSS содержат CAGE-seq кластеров, и мы обнаружили именно такой кластер внутри lcp1 первый интрон (). В хромосомных координатах максимальный сигнал CAGE был расположен в 5-дюймовом конце «предгорья» восточной восточной долготы. Онтогенетически пики стали обнаруживаться при 30% эпиболии и сохранялись. посредством сегментации (стадия 14–19 сомитов).Похожая картина была наблюдались для двух типов активирующих гистонов — h4K4me и h4K27ac — которые были присутствует от купола до стадии щита, но отсутствует на предшествующей и более поздних стадиях ( а также ). Эти гистоновые метки связаны с РНК. полимеразы II и обычно предсказывают транскрипционно активную или «Уравновешенные» последовательности (Адай и др. др., 2011).

2.6.3. Этап-специфическая RNA-seq читает

Наконец, при просмотре RNA-seq читает эту карту в lcp1 первый интрон и первый кодирующий экзон, мы обнаружили онтогенетически двухвалентный транскрипционный ландшафт с отчетливыми различиями между ранней и поздней стадиями ().Начиная с стадии купола, эмбрионы активируют интронную TSS, генерирование последовательностей РНК, пересекающих границу интрон-экзон. Однако по поздняя сегментация (prim-5 и более поздние) считывает карту только до канонической первой кодирующий экзон. Эта граница экзона сохраняется на более поздних личиночных стадиях и в многие ткани взрослого человека.

Этап-специфическая транскрипционная активность рыбок данио LCPL ECR4.

A. Схема первого кодирующего экзона LCP1 . 5 ’UTR = фиолетовый; кодирующая белок область = зеленый.

B. Соединенные EST образуют незаметный «Предгорье» перед первым кодирующим экзоном.

C. RNA-seq читает поэтапно. Интронное выражение (оранжевый) — это отсутствует до стадии купола, но становится сильным при 30% эпиболии и сохраняется до сегментация (14–19 сомитов). В дальнейшем интронная активность чтения отсутствует. этапы (темно-зеленый), которые показывают только каноническое выражение первой кодировки экзон. Источник: UCSC Genome Browser, DANIO-CODE track hub

Таким образом, выравнивание геномов нескольких рыб выявляет множественные эволюционно консервативные элементы (ECR) в первом интроне LCPL .Нормативные аннотации генома рыбок данио показывают, что у этого вида 3 ’конец интрона содержит специфический для стадии TSS, который максимально активен от эпиболии до сегментация. На более поздних стадиях его транскрипционная активность прекращается. Это состояние двухвалентного хроматина согласуется с переключением в L-пластине. экспрессия от ранних клеток EVL к более поздним лейкоцитам и выявляет возможные интронный механизм двухэтапной регуляции этого гена.

2.7. Оценка in vivo активности промотора lcp1

Из нашей исходной конструкции HDR, содержащей как 5 ’, так и 3’ В плечах гомологии мы произвели пять модифицированных фрагментов для анализа промотора. in vivo .Плечо 3 ’гомологии было полностью удалено, так как там было обнаружено мало регуляторных мотивов. В пределах плеча 5 ’гомологии мы разработали серию делеций из шести конструкций (). Поскольку начало транскрипции еще не было определено, каждый конструкция была названа в соответствии с количеством оснований 5 ’ трансляционный стартовый кодон (ATG) в нашей сконструированной последовательности Козака. После субклонирование, секвенирование и очистка, каждую конструкцию вводили отдельно в зиготы рыбок данио, а здоровые эмбрионы были проверены на 50% эпиболии на Экспрессия EGFP в клетках EVL.

In vivo валидация промотора первого интрона у рыбок данио и энхансерная активность.

A. СЛЕВА: 5 ’делеционная серия рыбок данио 5 ’плечо гомологии перед трансгенной кассетой ( lcp1 : Cre-P2A-EGFP-CAAX, сокращенно «EGFP»). Конструкции пронумерованы в соответствии с количеством баз выше по течению. сайт начала инженерного перевода (АТГ, где A = +1.) A. ПРАВО : Результаты Инъекции делеционной серии. Зеленые столбцы = доля инъецированных эмбрионов с Клетки EGFP ⁺ EVL.Серые линии = 95% доверительный интервал на пропорция.

Б-Ф. Крышка для животных, виды инъекций, EGFP ⁺ эмбрионы собраны на 50% эпиболии.

G. Аннотация минимальной интронной области (−481 до -169), достаточного для активности EVL. Прямая ПЦР с делецией и конструкцией грунтовки подчеркнуты. Прогнозируемая стенограмма в ВЕРХНИЙ РЕГИСТР. TATA = Мотив коробки TATA; TSS = транскрипция стартовый сайт; DPE = нижележащий промоторный элемент.EST «Предгорье» (см. И ) закрашен желтым.

Из шести протестированных конструкций четыре самых длинных фрагмента (-990, −882, −658 и −481) дали аналогичные распределения ярко маркированные клетки EVL (-). В рамках каждого лечения доля трансформированные эмбрионы сильно варьировали (43–77%), как и количество меченых клеток на эмбрион. Два самых коротких фрагмента (−169 и 0) не произвел никаких сигналов (). Мы заключаем что область примерно ~ 300 п.н., между -481 и −169, достаточно, чтобы управлять выражением EVL. In silico анализ этой области с использованием предиктора эукариотического промотора (YAPP, www.bioinformatics.org / yap; Gershenzon and Ioshikhes, 2004; Jin et al., 2006) подтвердил синергетическую пару основные элементы (TATA / DPE) в этом интервале (). Предсказанная расшифровка стенограммы, которая начинается между этими двумя элементы, соответствует как EST ‘foothill’, так и кластеру CAGE-seq в тот же регион. Открытие этих элементов в пределах 5 ’гомологии arm частично объясняет, как кассета lcpl : Cre-P2A-EGFP-CAAX может функционировать как мини-ген, управляя экспрессией EVL у эмбрионов рыбок данио.

3. Обсуждение

3.1. Характеристика экспрессии L-пластина у ранних рыбок данио development

Наиболее известная роль L-пластина — это лейкоцитарный маркер (Morley, 2012). Менее понятен его выражение в других контекстах. Здесь мы расширяем предыдущую работу над этим локализации мРНК гена и показывают, что L-пластин является высокоспецифичным маркер для EVL и его производной, эмбриональной перидермы. Используя антитела к L-пластину, специфичные для рыбок данио, мы обнаружили, что экспрессия белка в этих клетки пунктированы, с скоплениями или точками, разбросанными по цитоплазме.Этот пространственный образец согласуется с описанным для человеческих клеток, включая Т-клетки in vitro (Freeley et al. др., 2012). Подобные закономерности наблюдались у C. albicans дрожжевых почек (Zhang et al., 2016) и C. elegans зиготы (Ding et al., 2017), что указывает на широкую консервацию белка пластина / фимбрина. локализация у разнообразных эукариот. У рыбок данио L-пластин рано ограничение на EVL напоминает ограничение других генов, локализованных в EVL, включая молекула адгезии эпителиальных клеток EpCAM (Slanchev et al., 2009) и различных цито-кератинов (Imboden et al., 1997; Gong et al., 2002; Sagerstrom et al. др., 2005; Чен и др., 2011; Krens et al., 2011), расширяя список генетических маркеров этой популяции эмбриональных клеток.

Первоначальной целью нашего исследования было получение репортера L-пластина. экспрессия усиленного мембраной GFP во всех лейкоцитах, что позволяет детально наблюдение за их протрузивной и фагоцитарной активностью. Неожиданно мы произвел репортер L-пластина, который направляет GFP к EVL. Этот роман, стабильный line предоставляет отличную возможность визуализировать миграцию EVL, интеркаляция и дифференцировка in vivo .Во время данио В процессе развития EVL является первой тканью, имеющей отличительную морфологию. Его уплощенные клетки образуют защитный барьер, необходимый для регулирования осмотическое давление и поверхностное натяжение. Но это покрытие не стационарное, а миграция. Успешная эпиболия зависит от ползания клеток EVL с анимального полюса. над желтком с силой тяги, обеспечиваемой передним актомиозиновым кольцом (Ho, 1992; Solnica-Krezel et al., 1996; Yin et al., 2008). При сохранении бокового связи, клетки EVL также взаимно интеркалируют, чтобы уменьшить количество передовые клетки.Маркируя EVL локализованным на мембране EGFP, lcp1 : трансгенная линия Cre-P2A-EGFP-CAAX обеспечивает удобная оптическая платформа для наблюдения за этими характерными структурами и движения. При малом увеличении мы могли снимать живые эмбрионы до 18 часов без любая потеря сигнала. При большом увеличении длительность 30–40 мин. обеспечен хороший контраст; кроме этого, ухудшение сигнала можно исправить с помощью мягкая обработка изображений.

Неожиданное наблюдение в нашей линейке: lcp1 : Экспрессия EGFP-CAAX неоднородна, проявляется ярче или темнее в соседних Клетки EVL.Эта неоднородность проявляется на трех уровнях — после г. situ локализация мРНК после иммуноокрашивания белка и после геномной интеграции нашей конструкции промотора lcp1 . Какие вызывает этот эффект? Изначально мы рассматривали кальциевые волны. Во время гаструляции кальциевые волны возникают случайно, но неоднократно в кластерах клеток EVL (Slusarski et al., 1997; Webb and Miller, 2003). В поддержку этой концепции недавно опубликованный трансгенный репортер выделяет участки богатой кальцием EVL клетки, похожие по размеру и форме на то, что мы наблюдаем (Chen et al., 2017). Другие факторы, которые могли влияние выражения нашей конструкции включает несколько сайтов интеграции и переменные числа копий у двух самцов F1. Однако, как мы заметили Менделирующая наследственность этой вариации EVL в трех поколениях их потомков, маловероятно, что эти факторы применимы. Наша рабочая гипотеза что отдельные клетки EVL по-разному экспрессируют трансген на основе ранее существовавшие внутренние регуляторные состояния, которые влияют на унаследованный промотор. Эти состояния, пока неизвестные, могут лежать в основе наблюдения, что многие специфичные для EVL гены выражаются мозаично или в виде «соли и перца» (Fukazawa et al., 2010; Коткамп и др., 2014; Лю и др., 2015).

L-пластин важен, потому что он является одним из самых обильно экспрессируются белки в нормальных лейкоцитах, но неправильно экспрессируются во многих негемопоэтические раковые клетки. Какие особенности объединяли бы ЭВЛ, лейкоциты, и раковые клетки? Хотя лейкоциты и раковые клетки имеют очевидные фенотипическое совпадение, общие черты лейкоцитов и EVL меньше Чисто. Первые представляют собой отдельные амебоидные мезодермальные клетки, тогда как вторые представляет собой плоский эпителиальный лист.Несмотря на эти различия, тот факт, что оба экспрессия высоких уровней одного и того же цитоплазматического актинового пучка может указывать на общий функциональное требование. Поскольку считается, что связывание актина с помощью L-пластина стабилизировать выступы мембран в движущихся или исследующих клетках, мы предполагаем, что EVL использует L-пластин для стабилизации базо-латерального и радиально-направленного филопод при эпиболии. Эксперименты по проверке этой гипотезы сейчас продолжаются, скрещивание трансгенного lcp1 : Cre-EGFP с нашим недавно разработанные нокаутные линии lcp1 (Kell et al., 2018).

Путем выбора большого (~ 1 кБ) плеча гомологии для нашего запланированного HDR конструкция, мы непреднамеренно выделили новую интронную регуляторную последовательность. Мы обнаружили, что фрагмент рыбки данио lcp1 размером ~ 300 п.н. первого интрона достаточно, чтобы повторить экспрессию эндогенного L-пластина в гаструла и глотка. Хотя в классическом понимании промоторные элементы кластеризация на 5 ’концах локусов, полногеномные исследования транскрипции, трансляция и активность энхансеров показывают, что регуляция более диффузная, чем ранее ценился.Большинство генов имеют несколько TSS — в среднем четыре — которые регулируется сложным образом (Carninci et al., 2006; Непал и др., 2013; обзор Багчи и Айер, 2016). Первый Также известно, что интроны играют важную регуляторную роль. В частности, 5 ’и 3’ концы таких интронов, как правило, защищены от вкрапленные повторы и другие мутации, отражающие отбор по ключевым мотивам рядом с площадками стыковки (Маевски и Отт, 2002). Эта модель хорошо применима к последовательности lcp1 изолированной здесь, в которой альтернативная TSS лежит непосредственно рядом с первый кодирующий экзон.Поэтому интроны следует исследовать на наличие редких, но возможно важные элементы регулирующего контроля.

3.2. Заключительные замечания

Хотя ранние исследования L-пластина идентифицировали этот ген в миелоидном линии и раковые клетки, мы подтвердили, что он также экспрессируется во время гаструляция рыбок данио. Вставив многофункциональную трансгенную кассету ниже интронной последовательности lcp1 , мы смогли экспрессировать как сайт-специфическая рекомбиназа, так и флуоресцентный индикатор в EVL и перидерма, предоставляя новый инструмент для изучения этих популяций клеток.Данный что эмбрион рыбки данио является выдающейся оптической платформой для оценки клеток поведение in vivo, вполне вероятно, что это станет совершенно новый контекст для изучения функции белка L-пластина. Легкость химическая и генетическая модификация эмбриона, а также наличие многочисленные трансгенные и мутантные линии также ускорят исследования в этом площадь.

4. Материалы и методы

4.1. Штаммы рыб и разведение

Комитет по уходу и использованию животных Университета ДеПола (IACUC) одобрил все протоколы для животных.Взрослую рыбу содержали в отапливаемом, рециркуляционная стеллажная система при 28 ° C в цикле свет-темнота 14:10 с максимальная плотность посадки 1 рыба / 200 мл. Диета для взрослых представляла собой смесь 50:50 тонкоизмельченные хлопья (TetraMin) и декапсулированные яйца рассольных креветок (американские Brine Shrimp) один или два раза в день.

Оплодотворенные яйца были получены путем помещения взрослых пар в 500 мл переходной бак, заполненный системной водой. Клатчи были собраны следующие утренние и неоплодотворенные эмбрионы удаляются.Через 5–6 дней развития плоть переводили в автономную систему сокультивирования коловраток (Best et al., 2010) на срок до одной недели до переход на стандартное жилье. Личинок кормили живыми коловратками и мелкими количества покупной порошковой диеты (Golden Pearl ™ 50–100 и 100–300 мкм пищевые).

4.2. . Полная иммуногистохимия

Процедуры, использованные в этом исследовании, следовали нашим предыдущим опубликованным отчеты (Фигероа и др., 2015; Келл и др., 2018). Кролик против рыбок данио L-пластин, добрый подарок доктора В.Майкл Редд, использовался в 1: 20,000–1: 50,000 (Redd et al., 2006 г.). Использовали мышиную рекомбиназу против Cre (MAB3120, Sigma-Aldrich). at 1: 2000–1: 4000. Флуоресцентные вторичные (козий антикроличий Cy3 и / или козий антимышиный Cy3; Jackson ImmunoResearch) применяли в соотношении 1: 200 либо с или без DAPI (1 мг / мл) для окрашивания ядер.

4.3. Конструирование трансгенной линии lcp1: Cre-P2A-EGFP-CAAX

4.3.1. Выделение геномной ДНК

Рыбы были анестезированы с использованием забуференного трикаина в концентрации 0,015% мкг / мл. (Sigma-Aldrich: E102521) в системной воде, а затем в дистальной половине хвостовой плавник удален с помощью лезвия бритвы.Рыбе разрешили восстановиться в вода из системы плюс метиленовый синий на ночь, прежде чем возвращать в рециркуляционная система. Отдельные зажимы хвостового плавника помещали в пробирки для ПЦР. содержащий 50 мкл свежеприготовленного буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl, 50 мМ KCl, 0,3% Tween-20 и 1% Triton-X 100) и инкубировали при 98 ° C в течение 10 мин. После добавления протеиназы К (10 ЕД) лизис продолжался при 55 ° C. в течение 2–3 ч или на ночь. После тепловой инактивации при 98 ° C в течение 10 мин неочищенные лизаты встряхивали, центрифугировали и хранили при −20 ° С.Для ПЦР использовали 2–4 мкл лизата. супернатант в типичном реакционном объеме 20–50 мкл.

4.3.2. Дизайн и валидация направляющей РНК

В пределах lcp1 exon1 мы определили удобный прилегающий мотив протоспейсера (PAM) в пределах сайта рестрикции Hpy188I. С использованием эту последовательность, мы разработали направляющую РНК против оснований немедленно вверх по течению (). синтез гРНК и очистка следовала методам, описанным в нашем предыдущем отчете (Kell et al., 2018). перечисляет использованные праймеры.

Мы проверили эффективное расщепление Cas9 на целевом сайте путем инъекции в 1–2-клеточные эмбрионы смесь 50 нг / мкл направляющей РНК, 150 нг / мкл мРНК Cas9, 300 мМ KCl и 0.5% феноловый красный. Двадцать четыре часа после инъекции индивидуальные эмбрионы были генотипированы с помощью диагностической ПЦР. пара праймеров, фланкирующая сайт-мишень Hpy188I (). Эти праймеры образуют ампликон из 193 bp, которые при разрезании Hpy188I дают четыре фрагмента на аллель дикого типа: 93 п.н., (2 × 44) п.н. и 12 п.н. Полоса 12 п.н. трудно увидеть, поэтому на практике шаблон ограничения дикого типа выглядит как дублет (). Indel-модифицированные эмбрионы вероятно, будет удален один участок разреза, в результате чего будет получен уникальный фрагмент (93 + 44) = 137 п.н.Таким образом, мозаичный образец ограничения представляет собой триплет с диагностическая полоса большего размера ().

4.3.3. Конструкция донорного вектора

Донорный вектор ( lcp1 : Cre-P2A-EGFP-CAAX) был планируется как сборка Гибсона из трех продуктов ПЦР: фрагмента Cre-P2A, Фрагмент EGFP-CAAX-SV40-polyA и скелет вектора (pGEM-T Easy) содержащие два плеча гомологии размером ~ 1 кБ, фланкирующие lcp1 экзон 1 (). Все фрагменты были амплифицирован с использованием высококачественной полимеразы (Q5 Hi-Fi 2 × Master Mix, New England Biolabs), подтверждено гель-электрофорезом и очищено с использованием стандартные колонки (Zymoclean ^™ Gel DNA Recovery Kit, Zymo Исследовать).Комбинации праймеров см.

Мы субклонировали фрагменты Cre-P2A и EGFP-SV40-polyA с помощью одностадийное субклонирование из существующих исходных плазмид (). Используя показанные праймеры, Cre фрагмент имел длину 1100 п.н., а фрагмент EGFP-CAAX имел длину 1392 п.н. Мы произвел плеч гомологии lcp1 путем двухэтапного субклонирования (). Сначала мы разработали пара праймеров для амплификации участка геномной ДНК рыбок данио длиной 2804 п.н. с центром на экзон-мишень lcp1 (zv11, chr9: 56 257 654–56 260 457).Затем мы T / A клонировали этот продукт в pGEM-T Легко сформировать круг размером 6 КБ. После подтверждения последовательности мы разработали вторая пара праймеров для обратной ПЦР. Используя показанные праймеры, это произвело ~ 6 кБ линейная молекула. Наконец, мы собрали все три фрагмента для 60 мин при 50 ° C при соотношении M 1: 2: 2 каркас: вставка: вставка (Набор NEBuilder, New England Biolabs).

Мы добавили 2 мкл этой реакции сборки в химически компетентные клетки E. coli (NEB-5α, Новая Англия BioLabs) с последующим тепловым шоком и посевом на селективную среду.После колонии ПЦР, мы расширили несколько клонов и секвенировали их сторонним поставщиком. (Геневис, Саут-Плейнфилд, Нью-Джерси). Использование программного обеспечения для выравнивания DNADynamo (v1.484) мы обрезали и выровняли поставляемые файлы трассировки, чтобы найти клоны с правильная открытая рамка считывания. Мы вырастили одного клона («1.1.18»). до объема мидипрепа (Zyppy ^™ Plasmid Midiprep Kit, Zymo Research), затем очищенную плазмиду хранили в одноразовых аликвотах в −20 ° С.

4.3.4. Трансгенез эмбрионов и скрининг потомства

Сбор и установка яиц проводились стандартными методами (Yuan and Sun, 2009).Мы смешали циркулярные донорный вектор (15–60 нг / мкл), lcp1 exon 1 guide РНК (100–150 нг / мкл) и рекомбинантный локализованный в ядре Cas9 белка (600 нг / мкл) в растворе 0,5% фенолового красного и 300 мкМ KCl. После перемешивания этот раствор хранили при комнатной температуре. на протяжении всего эксперимента. Затем мы провели инъекции желтка в одноклеточную этап с использованием микроинжектора прямого вытеснения (Nanoject III, Drummond Scientific), добавляя примерно 2 нл на эмбрион.

Мы довели выживших основателей мозаики (F0) до зрелости, затем перешли их к диким типам.Использование эпифлуоресценции для скрининга кладок на 70% эпиболии, вручную отбирали самое яркое зеленое потомство, потом выращивали они производят F1. При скрещивании с дикими типами все F1 дали ожидаемое соотношение трансгенного: потомства дикого типа 50:50. Эти лапы были снова просматривается и выбирается, устанавливая F2. Когда скрещено с диким типов, все F2 давали 50% светлого трансгенного потомства, что подтверждает стабильность трансмиссия более четырех поколений.

4.4. Конфокальная микроскопия и обработка изображений

Все изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего устройства Leica SP5. микроскоп.Фиксированные эмбрионы помещали в чашки Петри со стеклянным дном (MatTek P35G-0–20-C) в 50% глицерине с трис-буфером (pH 7,2–7,6). Жить эмбрионы переносили в большие стеклянные чашки Петри, содержащие 1 × E3 средний, затем дехорионирован вручную. Камера для получения изображений в реальном времени представляла собой стеклянное дно. Чашка Петри, в которую был добавлен тонкий (1-2 мм) слой тугоплавкой агарозы. в 1 × PBS. После того, как этот слой застыл, мы использовали тупое дозирование мелкого калибра. иглами для пробивания вертикальных цилиндров агара над покровным стеклом, образуя «Поле для гольфа» на 10–12 лунок.Использование полированного стекла пипеткой, мы загружали 2 или 3 дехорионированных эмбриона в каждое отверстие так, чтобы эмбрионы слегка касались друг друга и окружающего агара. Мы тогда Залил пластину доп Е3. В этом препарате погруженные эмбрионы были стабилизированы, но все еще могли совершать морфогенетические движения. Контакт с жидкие или вязкие монтажные среды избегали, чтобы не повредить EVL или ограничить распространение.

Для получения изображений с интервальной съемкой подготовленные чашки с агаром накрыли и поместили на увлажненном столике микроскопа при 28 ° C.Чтобы задокументировать эпиболию, мы использовали 20-кратный воздушный объектив для съемки изображений каждые 1-2 мин в течение до 8 часов. К документ ЭВЛ протрузивная активность, мы использовали масляную иммерсию 40 × или 60 × линзы для захвата изображения каждые 30–45 с в течение 40–60 мин. Чтобы свести к минимуму обесцвечивание, все сканированные изображения были в среднем разрешении (512 × 512) с использованием минимальная необходимая мощность лазера. Наборы данных 3D и 4D были экспортированы как файлы ..lif и обработано в FIJI и FluoRender (Schindelin et al. др., 2012; Wan et al., 2012). используя определенный рабочий процесс встроенных команд (удаление пятен, Z-проекция, регулировка яркости / контрастности, вычитание фона и коррекция дрейфа.) Обработанные изображения были экспортированы как файлы TIFF высокого разрешения для рисунка. подготовка (Adobe Creative Suite 6) или в виде файлов AVI для редактирования видео (Movavi Video Suite).

4.5. Репортерный анализ Cre-рекомбиназы

Наша репортерная плазмида для Cre-рекомбиназы была собрана как открытая рамка считывания, управляемая убиквитином ( ubtloxp-STOP-loxp-mCD8a-TagRFP-T) в стандартном Tol2 плазмидный вектор ( pDEST-Tol2-p2A2 ). Кассета с флоксированным упором была расположен между промотором ubi и кодирующей областью, содержащей поверхностный гликопротеин Т-клеток мыши (mCD8a, из клона Addgene # 17745) и мономерный красный флуоресцентный белок (TagRFP-T, см. Shaner et al., 2008). Рекомбинация удаляет остановку в восходящем направлении кассета, позволяющая синтез слитого белка. Для расширенных примеров аналогичные управляемые убиквитином конструкции в векторной системе Tol2, см. (Mosimann et al., 2011).

После стандартной очистки ДНК кольцевую плазмиду хранили в одноразовые аликвоты при -20 ° C. Инъекция в одноклеточные эмбрионы следовали общим процедурам в 4.3.4. Для транзиторного трансгенеза Реакционная смесь содержала 75–100 нг / мкл плазмидной ДНК.

4.6.Анализ эволюционно консервативных элементов

Для обнаружения межвидовых эволюционно-консервативных областей (ECR) мы использовали набор программ mVISTA (genome.lbl.gov/vista/). Этот набор выравнивает несколько входов последовательности, затем извлекаются области, которые превышают определенный порог сходства (Mayor et al., 2000; Frazer et al., 2004). Были получены входные последовательности из эталонных геномов в Ensembl. Выравнивания производились без повторное маскирование с использованием опции выравнивания LAGAN (Brudno et al., 2003). Пороговое значение p-значения по умолчанию было 0,5.

4.7. Серия делеций промотора и скрининг экспрессии

Для оценки регуляторной активности lcp1 5 ’ На руку гомологии мы сделали серию делеционных конструкций (). Мы разработали пять различных прямых праймеров. против общего обратного праймера (), амплифицировал фрагменты с помощью корректирующей полимеразной смеси (Q5 Hi-Fi, New England Biolabs) и очистили фрагменты от гелей агарозы. ДНК восстановление производилось модифицированным методом «замораживания и сжатия» (Thuring et al., 1975). Вкратце, мы собирали каждый срез 1% агарозы в пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, измельчали его микропестиком и заморозили при −80 ° C на 1–2 часа. После оттаивания мы снова измельчали ​​и вращали при 20000 г в течение 15 минут, чтобы восстановить очищенный супернатант. После очистки осаждением ацетатом натрия / этанолом, продукт был модифицирован для клонирования T / A с использованием Bullseye ^™ Taq. (MidSci Scientific). Затем фрагменты с A-хвостом лигировали в pGEM-T Easy вектор клонирования, такой же скелет, как исходная последовательность.

Таблица 4

Праймеры и условия ПЦР для субклонирования промоторов.

После бактериальной трансформации, клональной экспансии, выделения ДНК и Для подтверждения последовательности каждую конструкцию вводили в одноклеточные эмбрионы (см. 4.3.4). Раствор для инъекций содержал 75 нг / мкл кольцевой плазмидной ДНК, 300 мМ KCl и 0,5% фенолового красного в воде, свободной от нуклеаз. Контрольным эмбрионам вводили «Козак». только конструкция, содержащая полную открытую рамку считывания (Cre-P2A-EGFP-CAAX), но без 5’-фланкирующей последовательности. Введенные эмбрионы были вернулся в яичную воду при 28,5 ° C и зафиксировал 50% эпиболии. Фиксированные эмбрионы помещали в 1% -ный тугоплавкий агар в яичной воде так, чтобы шапочка животного была лицом к покровному стеклу. Конфокальные изображения были собраны в виде стопок по 75 мкм. начиная с анимального полюса внутрь.Получение и обработка изображений производились как описано в 4.4.

4.8. Графическое представление данных и статистическая проверка нулевой гипотезы

Мы построили график результатов делеционной серии с помощью программного обеспечения Prism и проверили вариации внутри и между курсами лечения с использованием 95% доверительных интервалов для пропорция (Newcombe, 1998).

4.9. Ключевые ресурсы

Дополнительные данные об экспериментальных реактивах, ресурсах и поставщиках представлены в документе «Ключевые ресурсы».

Толпы растут по мере того, как искрится ловля судака на озере Эри: отчет о рыбалке в северо-восточном Огайо за выходные 11-13 июня

КЛИВЛЕНД, Огайо — Рыбалка на судака на озере Эри продолжает оставаться выдающейся на всем побережье Огайо, а это означает, что лодки и рыболовы, особенно вокруг островов озера Эри.

После 15 месяцев строгих ограничений на передвижение на канадской границе из-за COVID-19 ходят слухи, что американским рыболовам может быть снова разрешено ловить рыбу в канадских водах вокруг острова Пели и Западного озера Эри, когда последние ограничения истекают в конце июня. .

Рыбаки на этой неделе сосредоточили свое внимание на водах озера Эри в районе острова Норт-Басс на канадской границе.

Учитывая рекордную численность судака в этом году, как традиционная дрифтерная ловля, так и высокотехнологичный троллинг оказались очень продуктивными.Многие мелкие судаки обучаются стайками на более мелких участках, но трофейные судаки также многочисленны.

Рыбаки, проводящие заброс, нацеливаются на судака, который висит на глубине от 8 до 10 футов для кормления, полагаясь на медленное извлечение, чтобы получить поклевку. Небольшие спиннеры и спиннеры с опрокидыванием вперед с наклоном на ночной краулер являются стандартом.

Рыбаки, занимающиеся троллингом, по-прежнему работают с водолазными вилками в стиле гольяна за лодкой, но на этой неделе в отчетах о рыбалке, похоже, преобладают водолазы и маленькие блесны.

От Гурона до Кливленда уловы прибрежного судака были очень хорошими на глубине 18–30 футов, а также при ловле на более глубокой воде. Капитаны чартеров сообщают о постоянных ограничениях и часто возвращаются в доки на обед с полным кулером.

Хальтер, результат Хустски в Bass Classic

Кливлендские рыболовы Рэй Хальтер и Аль Хустски запечатлели 21-й ежегодный турнир Muransky Companies Bass Classic, который приносит пользу United Way of Youngstown и Mahoning Valley в прошлую субботу второй год подряд.Холтер поставил на якорь свой 22,19-фунтовый лимит в пять басов из Пайн-Лейк с большим ртом, который поднял чашу весов до 6,25 фунта, а Хустски вложил 5,16 фунта.

На озере Эванс у Тома Ролланда и Тони Карра был трофей в 5,3 фунта и лимит в 23,02 фунта.

Пайн и Эванс — это озера Аква Огайо, которые обычно не открыты для публики, но участвуют в ежегодном мероприятии United Way Bass Classic. За эти годы турниры собрали для United Way более 500 000 долларов.

Возьмите папу на рыбалку на День отца

Если вам интересно, что подарить папе на День отца в воскресенье, 20 июня, больше не беспокойтесь.Лучшим подарком было бы взять его на рыбалку в Fish for Free Weekend, который проходит 19-20 июня в Огайо. Специальные выходные, спонсируемые Отделом дикой природы Огайо, не требуют лицензий на рыбную ловлю.

Может быть немного сложно найти гида по рыбалке на озере Эри, которого не забронировали в этот особенный день, но проверьте наличие лодок для вечеринок в районах Порт Клинтон и Марблхед.