Ван сунгур: Погода в Троицком Сунгуре сегодня, прогноз погоды Троицкий Сунгур на сегодня, Новоспасский район, Ульяновская область, Россия

CaSR (установлено в нашей группе) и NLRP3-дефицитные (Invivogen) клетки THP-1 культивировали в RPMI1640 / 10% FBS / 1% пенициллин и стрептомицин (pen / strep) и селективных антибиотиках, как указано в таблице данных. Анализы проводили в 24-луночных планшетах. 5 × 10 ⁵ клеток на лунку высевали для дифференцировки в 50 нг / мл PMA (Tocris) -содержащей среды в течение 2 дней перед LPS-примированием (100 нг / мл) и стимуляцией.

Следующие ниже реагенты и ингибиторы были использованы в нескольких экспериментах с культурами клеток. Na ₂ HPO ₄ , BaCl ₂ , фетуин-A от FBS были приобретены у Merck, CaCl ₂ , трехосновный гексагидрат фосфоноформиата натрия, от Sigma, YM254890 от Wako chemical, Calhex231, Latrunchalasin A, NPS2143, D от Tocris, латрункулин B, PAF C-16, LLOMe от CaymanChemicals, MgSO ₄ от AppliChem, АТФ от Roche, DMSO от Serva, N-fMLP от abcam и CA-074-Me от Selleck-Chem.

Нокаут Crispr / Cas9 CaSR в клетках THP-1

Клетки THP-1 трансдуцировали лентивирусными частицами Cas9 (Dharmacon, Edit-R Lentiviral hEF1α-Blast-Cas9 Nuclease Particles, № по каталогу VCAS10126). 5 × 10 ^{4 клеток} трансдуцировали при MOI 3 в 250 мкл RPMI с 1% FBS без антибиотиков. После 16-часовой трансдукции среду заменяли 500 мкл RPMI1640 / 10% FBS. Для селекции через 48 ч после трансдукции в культуральную среду добавляли 10 мкг / мл бластицидина. Перед дальнейшим использованием клетки отбирали на 1 неделю.Концентрации бластицидина и пуромицина (Invitrogen) для отбора были установлены заранее с помощью кривой уничтожения антибиотика.

Cas9 была подтверждена вестерн-блоттингом (Cell Signaling, антитело Cas9 7A9-3A3, № по каталогу 14697S). Затем трансдуцированные Cas9 клетки THP-1 трансдуцировали второй раз, как описано выше, лентивирусными частицами, содержащими sgRNAs против CaSR (Dharmacon, Edit-R Lentiviral mCMV-Puro-sgRNA Particles, клон VSGHSM_27523470, последовательность ДНК-мишень 5′-GGACCTTCTTCAGGAATTT -3 ′, кат.нет. VSGh20142) или не нацеливающую контрольную последовательность (нецелевые частицы sgRNA mCMV-Puro лентивируса Edit-R, № по каталогу VSGC10216). Через 48 ч трансдуцированные клетки отбирали 0,8 мкг / мл пуромицина в течение 1 недели. Дальнейшая культура клеток была такой же, как для клеток дикого типа THP-1, за исключением добавления двух селективных антибиотиков.

Чтобы гарантировать, что трансдуцированные клетки не выделяют вирусные частицы, был проведен ELISA p24 (Sino Biologicals, № по каталогу KIT11695) в соответствии с инструкциями производителя.

высевали в виде клонов отдельных клеток в 96-луночный планшет с U-образным дном на сортировщике клеток BD FACS Aria III (флуоресцентная технология Core Unit, Лейпцигский университет с помощью Катрин Джагер). Для лучшей скорости роста кондиционированную среду из текущей культуры клеток THP-1 смешивали в соотношении 1: 1 с RPMI1640 / 10% FBS, 1% pen / strep, но без селективных антибиотиков.

Через 3 недели клоны подвергали скринингу с помощью анализа обнаружения несоответствия (Takara, Guide-it Mutation Detection Kit, № по каталогу 631443).Последовательности праймеров для обнаружения несовпадения в гене CASR были сконструированы, охватывая целевой сайт sgRNA (прямой 5′-TGCAGCTGATGACGACTATG-3 ‘и обратный 5′-CTAAACCTGTCGCCACTTTCT-3’). Затем один клон, положительный в анализе на несовпадение по сайту CASR (CaSR70 B6), и один не нацеленный клон sgRNA, не содержащий несовпадения (Ctrl216 B6), затем использовали для дальнейших экспериментов. См. Дополнительный рис. 3e для результатов анализа несоответствия. Удаление пар оснований в целевой последовательности было подтверждено с помощью подготовки библиотеки ДНК Nextera (Illumina) и секвенирования продуктов ПЦР в ядре ДНК (Лейпцигский университет).Все последовательности CaSR70 B6 содержали делеции 13, 17 или 18 пар оснований, которые исключали персистентность гена дикого типа, и не присутствовали в клетках Ctrl216 B6 (см. Дополнительный рис. 3f).

Мыши

Эксперименты проводили с использованием мышей C57BL / 6 самцов / самок (дикого типа и мутантов CaSR). Мышей разводили и содержали в определенных условиях, свободных от патогенов (температура окружающей среды 22 ± 2 ° C, влажность 55 ± 15% и 12-часовой цикл темнота / свет) в помещениях для животных Medizinisch Experimentelles Zentrum, Университет Лейпцига, Германия.B6.129P2-Lyz2 ^{tm1 (cre) Мыши Ifo} (LysM-Cre) были приобретены в лаборатории Джексона, а мыши CaSR ^{flox / flox} были любезно предоставлены Wenhan Chang ⁶¹ . Мышей CaSR ^{flox / flox} скрещивали с трансгенными мышами, экспрессирующими Cre-рекомбиназу под контролем промотора LysM, и генотипировали перед всеми экспериментами. Использовали мышей в возрасте 2–8 месяцев.

Все эксперименты на животных были одобрены местными комитетами по уходу и использованию животных земли Саксония, Германия, в соответствии с рекомендациями Совета по этике животных (региональный административный орган, Лейпциг, Германия, T29 / 14, TVV27 / 19), а также Рекомендации NIH по уходу и использованию животных.

Экспериментальный артрит

CIA индуцировали у 10 мышей DBA / 1J (Harlan Winkelmann) в возрасте 7-8 недель иммунизацией 50 мкл 1: 1 (об. / Об.) Эмульсии CFA и 0,1 М уксусной кислоты, содержащей 50 мкг коллагена II типа цыпленка (CII; Chondrex) и 50 мкг убитого нагреванием Mycobacterium tuberculosis (Chondrex) в основании хвоста. Клиническая тяжесть артрита оценивалась количественно следующим образом: 0: отек сустава отсутствует, 1: отек сустава одного пальца, 2: не менее двух опухших суставов пальцев, 3: легкий отек запястья или лодыжки и 4: сильный отек запястья и лодыжка.Для каждой мыши подсчитывали количество всех передних и задних лап. Забор крови путем пункции сердца, перитонеального лаважа, промывки костного мозга из полостей бедренных костей и клинической оценки тяжести артрита выполняли на 40-й день после инъекции, когда мышей умерщвляли.

Для тестирования R568 CAIA индуцировали у 15 мышей DBA / 1J путем инъекции смеси антител 0,5 мг (ModiQuest Research, Нидерланды) и 10 мкг LPS (Sigma) внутрибрюшинно. 5 мышам дополнительно ежедневно вводили 150 мкл 33 мкМ R568 i.п., и 10 мышей контрольным раствором ацетата натрия. Тяжесть артрита оценивали ежедневно.

Кровь собирали пункцией сердца, мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием Ficoll-PaqueTM, а моноциты CD11b ⁺ выделяли разделением положительных магнитных шариков (Miltenyi Biotech). IL-1β в супернатантах клеточных культур измеряли с помощью ELISA мышиного IL-1β (BD Bioscience).

Измерение человеческого IL-1β

ELISA Set II человеческого IL-1β (BD Bioscience) использовали для обнаружения секретируемого IL-1β в супернатантах клеточных культур после стимуляции моноцитов в течение 16 часов или клеток THP-1 в течение 8 часов на клетку. условия культивирования (37 ° C / 5% CO ₂ ).ELISA выполняли, как описано в инструкциях производителя.

Окрашивание ASC-пятнышек

Для визуализации активации инфламмасом образование ASC-пятен выявляли иммунологическим окрашиванием ASC. 3 × 10 ⁵ моноцитов высевали в 96-луночные планшеты для визуализации клеток (MoBiTec) и стимулировали в течение 8 часов перед фиксацией 4% параформальдегидом (PFA, Merck) в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывания PBS неспецифическое связывание антител блокировали с помощью PBS / 50% AB-сыворотки человека в течение 30 мин.Затем антитела против ASC (1: 500 в PBS / 10% AB-сыворотке, поликлональные кроличьи антитела против ASC (AL177, AdipoGen Life Science)) инкубировали в течение 30 минут с последующей промывкой PBS и антителом против кроличьего AlexaFluor488 (1 : 100, Biolegend) инкубация в течение 30 мин. После промывки PBS клетки визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss Axio Observer.Z1 / AxioCamMRm3) и обрабатывали с помощью программного обеспечения Zeiss ZEN 2.

Измерение DMR

DMR было проанализировано с помощью системы Corning ^® EPIC ^® Biosensor и Epic Quest (R) 2.1.0.2. Анализ моноцитов проводился непосредственно после их выделения из периферической крови. 6 × 10 ⁴ моноцитов на лунку высевали в непокрытые микропланшеты EPIC ^® в среду для культивирования клеток RPMI1640 с добавлением 20 мМ HEPES. Перед стимуляцией моноциты предварительно инкубировали со 100 нг / мл ЛПС ± ингибитор для прикрепления к дну планшета (60 мин). Моноциты стимулировали раствором соединения и инкубировали в общем объеме 40 мкл в течение до 4 часов при 28 ° C во время обнаружения DMR.Для расчета зависимого от стимула DMR значения нестимулированных (LPS ± ингибитор) моноцитов вычитали из значений DMR-ответа стимулированных (LPS ± ингибитор ± стимул) моноцитов. Тот же протокол был выполнен для клеток THP-1, которые были засеяны для дифференцировки с плотностью 2,5 × 10 ⁴ c / w в 384-луночные аналитические планшеты без покрытия в среде, содержащей 50 нг / мл PMA за 2 дня до эксперимент.

Приготовление и стимуляция CPP

Для приготовления CPP 200 мкл RPMI1640 / 10% FBS (комнатная температура) смешивали с 5 мкл 100 мМ CaCl ₂ (2.5 мМ [Ca ²⁺ ]) в 1,5 мл пробирке Эппендорфа, встряхивают и центрифугируют в течение 2 ч при 16000 × г при 21 ° C. Для СРР, окрашенных кальцеином, в «среду СРР» добавляли 15 мкМ кальцеина (Sigma). После осаждения спонтанно образовавшихся CPP в течение 2 ч супернатант осторожно удаляли. Для стимуляции CPP осадок CPP ресуспендировали в 1 мМ [P _i ], содержащей среду для культивирования клеток, чтобы предотвратить образование новых CPP. 1x CPPs описывает содержимое CPP из 200 мкл «CPP-medium» из одной 1.Пробирка 5 мл, 2x CPP описывает количество CPP из двух пробирок. Если не указано иное, для стимуляции использовали 2-кратную концентрацию CPP. Для обнаружения фетуина-A в СРР осадок СРР (3x СРР) промывали 1 мМ [P _i ] RPMI1640 без FBS и снова центрифугировали в течение 2 часов перед ресуспендированием в буфере Лэммли (восстанавливающие условия) и загрузкой в 10% акриламид-SDS-гель и перенос на PVDF-мембрану (GE Healthcare) с помощью мокрого мазка. Фетуин-А был обнаружен с помощью козьего антитела против фетуина-А (N-20, Санта-Крус).Среду CPP фильтровали с помощью стерильного шприцевого фильтра Whatman ^® Anotop ^® 0,1 мкм.

Анализ CPP посредством динамического светорассеяния

DLS выполняли на Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Herrenberg) с He / Ne-лазером, работающим на длине волны λ = 633 нм, с использованием угла обнаружения 173 ° обратного рассеяния. После уравновешивания было проведено три измерения (3–20 прогонов) при 25 ° C. Для аппроксимации размера частиц использовали среднюю интенсивность основного пика или Z -среднее.Данные анализировали с помощью Malvern Zetasizer Software 7.11. Измерения были поддержаны группой Стефани Хёппенер, Йенский центр мягкой материи (JCSM) и группой Лукаса Вика (Биргит Вюрц), Центр экологических исследований им. Гельмгольца — UFZ Leipzig.

Анализ CPP и обнаружение поглощения CPP с помощью TEM-EDX

Изображения TEM были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai G² 20 (FEI / Thermo Fisher), работающего при ускоряющем напряжении 200 кВ. Чаще всего изображения были записаны с помощью программного обеспечения Olympus Soft Imaging Solution (OSIS) Megaview (1k) или системы камер Eagle 4k HS CCD.Обработка изображений выполнялась с использованием ImageJ 1.52 или Fiji. Определение характеристик частиц проводили с использованием крио-ПЭМ или блоттинга образцов на сетках ПЭМ с углеродным покрытием (Quantifoil, Германия), соответственно.

Крио-ТЕМ исследования

Для этих исследований 8,5 мкл водного водного раствора, содержащего СРР, наносили на сетки Quantifoil R2 / 2 (Quantifoil, Германия) с помощью Vitrobot Mark IV. Остекловывание образцов производилось жидким этаном. После блоттинга и погружения в замораживающую среду образцы переносили в криостадию Gatan и выдерживали при температуре жидкого азота до переноса в ПЭМ с использованием криодержателя Gatan 626.

Анализ размера частиц

Пятнадцать микролитров растворов наносили на сетку ПЭМ с углеродным покрытием и анализировали методом ПЭМ. Первоначально было проведено сравнительное исследование, чтобы проверить, действительно ли сушка частиц на TEM-сетке изменяет их форму или размер. Это было не так, и, следовательно, все исследования эволюции размера частиц, дополняющие исследования DLS, проводились с использованием этого подхода. Анализ размера частиц выполнялся программой Origin 9.0 с данными, извлеченными вручную из изображений ПЭМ.

EDX-анализ

EDX-спектры были получены с помощью системы Bruker Quantax. Результаты качественного картирования представлены в виде наложения предварительно выбранных элементов с цветовой кодировкой. Держатель FEI EDX с низким уровнем фона использовался для минимизации фоновых сигналов. Естественно, нельзя было избежать появления меди от используемых решеток ПЭМ и второстепенных сигналов от камеры. Выбор элементов был основан на обзорном сканировании с интегрированным анализом элементов в спектральном режиме. Попытки получить доступ к количественному составу частиц показали разные результаты и не были дополнительно количественно оценены в настоящем исследовании.Спектры, полученные на отдельных частицах, были получены путем интегрального сканирования луча в режиме STEM по соответствующей частице и интегрирования полученных сигналов.

Стимуляция клеток и подготовка к исследованиям ПЭМ

5 × 10 ⁶ свежевыделенных моноцитов периферической крови стимулировали 100 нг / мл ЛПС и 2,5 мМ CaCl ₂ в шестилуночных планшетах, покрытых 1,5% RPMI1640-агарозой ( Serva Electrophoresis) в среде для культивирования клеток RPMI1640 / 10% FBS.После инкубации при 37 ° C / 5% CO _{2 клетки} непосредственно фиксировали в среде для культивирования клеток с 2,5% глутаральдегидом и 4% PFA (электронная микроскопия) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей промывкой PBS.

Ультратонкие срезы инкубированных клеток получали путем постфиксации фиксированных клеток тетроксидом осмия (Science Services) в течение 1 ч при 4 ° C. Затем образец обезвоживали в этаноле с постепенным изменением концентрации (Acros Organics, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%).Полученный осадок клеток переносили в капсулы для пучка и предварительно заливали смесью 1: 2 эпоксидной смолы Embed 812 (Science Services) и этанола в течение 1 часа с последующей инкубацией со смесью 1: 1 в течение 1 часа и последующим погружением осадок в чистой смоле Embed 812 (Science Services) в течение ночи. Наконец, смолу и DMP смешали, чтобы получить отверждаемую смолу. Осадок инкубировали со смесью активированных смол и отверждали в течение> 24 ч в печи при температуре 80 ° C.

Полученные блоки образцов были обрезаны до размера ~ 1 × 1 мм и нарезаны с помощью RMC Powertome PTX (RMC, Boeckler) для получения ультратонких срезов толщиной ~ 80 нм.Срезы плавали на решетках ТЕМ с углеродным покрытием (Quantifoil). Пост-окрашивание иногда использовалось для улучшения контраста, но его избегали в случаях, когда проводился EDX-анализ, чтобы свести к минимуму присутствие сигналов, исходящих от пятен. Визуализация срезов выполнялась либо в режиме яркого поля, либо с использованием STEM для улучшения контраста.

Статистика и воспроизводимость ЭМ-экспериментов

Частицы были охарактеризованы с помощью крио-ПЭМ (рис. 1h, n = 2) для определения характерной формы частиц CPP после длительного периода инкубации в несколько дней.Дальнейшие исследования характеристик были выполнены на образцах, нанесенных на опорные решетки с гидрофилизированным углеродным покрытием, с учетом специфической структуры CPP, которая позволяет однозначно идентифицировать их по осадкам и отложениям буферного раствора (RPMI1640 / 10% FBS и 2,5 мМ [Ca ²⁺ ]). Исследования размера частиц CPP были проведены после 2 ч инкубации и показаны на рис. 1g. 230 независимых CPP были проанализированы для определения размера ( n = 1).

EDX-исследования были выполнены на двух произвольно выбранных областях, содержащих несколько наночастиц CPP, которые были подвергнуты блоттингу после длительной инкубации в течение нескольких дней (пример показан на рис. 1i). Кроме того, было получено> 5 спектров дополнительных индивидуальных CPP (пример см. Рис. 1j) на образец.

Три независимо приготовленных образца были исследованы для изучения поглощения CPP моноцитами человека. Поглощение было подтверждено в двух образцах, стимулированных CPP. По крайней мере, две области образца, показывающие события поглощения, были отобраны и дополнительно исследованы с помощью EDX-картирования (рис.1н). Кроме того, от пяти до шести отдельных CPP были дополнительно проанализированы путем получения полных спектров EDX (спектры для местоположений 1 и 4 показаны на рис. 1m, спектры EDX в других местах можно найти на рис. S2b) между 0 и 12 кэВ. . Положения анализируемых CPP отмечены на STEM-изображении, показанном на рис. 1l.

Конфокальная рамановская микроскопия

Конфокальная рамановская визуализация использовалась для обнаружения поглощения кальций-фосфатных наночастиц моноцитами. Рамановское изображение было выполнено с помощью Тома Венуса в сотрудничестве с Институтом медицинской физики и биофизики Лейпцигского университета.Моноциты были свежевыделены из периферической крови человека, и 1 × 10 ⁶ моноцитов были засеяны в чашки для визуализации клеток Эппендорфа (стеклянное дно 145 мкм) в среде RPMI1640 для достижения сверхприлипания в течение 60 минут (37 ° C / 5% CO _2. ). Среду заменяли 10% FBS, содержащим RPMI1640. Моноциты получали изображения до и после добавления 2,5 мМ [Ca ²⁺ ] с помощью конфокального рамановского микроскопа WiTec alpha300 R + с длиной волны возбуждения 532 нм (34 мВт, точечное отверстие 50 мкм) и объективом Zeiss W Plan Apochromat × 63/1. под контролем температуры (38 ° C).Спектры комбинационного рассеяния собирали по пикселям с использованием решетки ^-1 г / мМ 600 г, размер пикселя 250 мкм × 250 мкм и время интегрирования 70 мс. Изображения были получены и обработаны с помощью программного обеспечения WiTec Control FOUR и Project FOUR PLUS.

[Ca

Ca ^{2+. Концентрацию} измеряли, как описано ранее ² . Добавление 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5 мМ [Ca ²⁺ ] к RPMI1640 / 10% FBS привело через 2 часа к следующим непосредственно измеренным значениям [Ca ²⁺ ]: 0.6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,6 или 1,7 мМ (подробнее см. Каталожный номер ² ).

Синовиальная жидкость была получена путем анаэробного отбора проб, и концентрация Ca ²⁺ была измерена с помощью радиометра серии ABL 90 (Radiometer GmbH).

Для определения [Ca ²⁺ ] в костном мозге мышей костный мозг получали однократной промывкой бедренной кости 100 мкл 0,9% NaCl. Клетки удаляли центрифугированием. [Ca ²⁺ ] измеряли в супернатанте. Конечный [Ca ²⁺ ] был рассчитан путем умножения измеренного [Ca ²⁺ ] в 100 мкл на коэффициент разбавления (соотношение между объемом промывки 100 мкл и расчетным объемом промытой полости костного мозга бедренной кости. ).

Обнаружение экспрессии белка CaSR с помощью вестерн-блоттинга

Экстракты целых клеток из свежевыделенных моноцитов от шести пациентов с РА и семи здоровых доноров были получены путем лизирования 2 × 10 ⁶ клеток в буфере для лизиса RIPA и инкубирования в невосстанавливающем буфере Лэммли в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидную мембрану (GE Healthcare) с использованием устройства для переноса в соответствии с протоколами производителя (Bio-Rad).Мембрану инкубировали с раствором Ponceau S (P7170, Sigma-Aldrich) в течение 60 мин для проверки равной загрузки и переноса белков. Мембрану блокировали 5% соевым белком (Vitasyg) в TBST (10 мМ Трис, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5% Tween 20) в течение 60 минут, затем промывали трижды, по 10 минут каждый, с TBST и инкубировали с антителами. против CaSR (Alomone labs, № по каталогу ACR-004) (1: 200) в течение ночи при 4 ° C. Мембрану промывали трижды по 10 мин и инкубировали с разведением 1: 2500 антикроличьих антител (7074 S, Cell Signaling) в 5% соевом белке в TBST в течение 1 ч при комнатной температуре.Блоты трижды промывали TBST и проявляли с помощью системы ECL.

Интенсивность полос измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ 1.52 и рассчитывали отношение интенсивности полосы CaSR к интенсивности окрашивания Ponceau S соответствующей дорожки.

Иммунохимия

Замороженные синовиальные ткани, залитые соединением ОКТ, разрезали на срезы 5 мкм, фиксировали в ацетоне в течение 10 мин и сушили на воздухе. После блокирования нормальной козьей сывороткой слайды инкубировали с кроличьими поликлональными антителами против CaSR (Santa Cruz, клон h200) в течение 1 часа.После инкубации со вторичными козьими антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой или фосфатазой, проявлялись пятна с субстратами 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорид (DAB) или 3-амино-9-этилкарбазол (AEC), соответственно. Срезы контрастировали гематоксилином.

Ионизированный кальций в срезах синовиальной ткани окрашивали кальциевым красным (Глиоксаль-бис (2-гидроксианил, GBHA) в течение 5 мин. В указанных экспериментах срезы синовиальной ткани предварительно инкубировали с 20% раствором EDTA.

Обнаружение макропиноцитоза

Среда для культивирования клеток, окрашенная кальцеином, или окрашенные кальцеином CPP использовали для обнаружения макропиноцитоза моноцитов. Для последнего образование CPP индуцировалось в присутствии 15 мкМ кальцеина. Свежевыделенные моноциты высевали на 1,5% RPMI1640-агарозу (Serva) в адаптированной или стандартной среде для культивирования клеток RPMI1640 в присутствии 15 мкМ кальцеина или 1х кальцеин-окрашенных CPP. Моноциты стимулировали в течение 45 минут при 37 ° C / 5% CO ₂ и затем дважды промывали PBS / 1% BSA или только PBS.Поглощение кальцеина определяли с помощью проточной цитометрии (LSR II, BD Biosciences, BD FACS Diva 8.0.6) или анализа Amnis ^® ImageStream ^X Mark II (Ch04 — Brightfield, Ch02 — кальцеин, INSPIRE для ISX mkII версии 200.1. 388,0). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo V10.1 или IDEAS 6.2, и процент зависимого от стимула поглощения был рассчитан с использованием LPS-триггерного поглощения в качестве контроля (5% кальцеин-положительных моноцитов в качестве порогового значения).

Для анализа на WT и ТНР-1 с дефицитом CaSR клетки высевали на 1.5% RPMI1640-агароза в RPMI1640 / 1% пенициллина и стрептомицина (pen / strep) без FBS и инкубировали при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 16 часов. 3 × 10 ^{5 клеток} / лунку (48-луночный планшет) затем высевали на 1,5% RPMI1640 / 1 мМ [P _i ] -агарозу в RPMI1640 / 1 мМ [P _i ] и стимулировали 2x кальцеином. -окрашенные CPP и 2,5 мМ [Ca ²⁺ ] в течение 10, 20, 30 и 60 мин. После двукратной промывки PBS / 1% BSA клетки фиксировали 4% PFA в течение 15 мин при 4 ° C. Клетки THP-1 промывали PBS, и поглощение CPP определяли с помощью анализа Amnis ^® ImageStreamXMark II.Данные были проанализированы с помощью IDEAS 6.2, и процент зависимого от стимула поглощения был рассчитан с использованием [Ca ²⁺ ] -независимого поглощения в качестве контроля.

Определение активности катепсина

Тест Magic Red Cathepsin-B (ImmunoChemistry Technologies) использовали для определения активности катепсина B в моноцитах. Анализ проводили, как описано в инструкциях производителя. Активность катепсина определяли через 3 часа инкубации в среде для культивирования клеток, содержащей 1 или 5,6 мМ [P _i ].Флуоресценцию измеряли с помощью планшет-ридера Tecan infinite M200 (Ex 592 нм / Em 628 нм) и Tecan Magellan V7.2.

Обнаружение лизосомальной утечки

Лизосомальной утечки было обнаружено, как описано ранее ⁴² . Вкратце, моноциты высевали на 1,5% RPMI1640-агарозу и загружали 2 мкг / мл акридинового оранжевого (Thermo Fisher) в течение 20 минут при 37 ° C / 5% CO ₂ . После промывания моноциты ресуспендировали в свежей среде для культивирования клеток и высевали в новые покрытые агарозой планшеты.Моноциты стимулировали 100 мкг / мл MSU (Invivogen) в качестве контроля. Далее, 500 мкМ LLOMe (CaymanChemicals) (добавлено за 10 мин до анализа) использовали для индукции разрыва лизосомы и, следовательно, для различения разорванных / протекающих лизосом и функциональных лизосом для анализа. Потеря окрашивания акридиновым оранжевым (Ex 488 нм / Em 650 нм) была использована в качестве индикатора лизосомальной утечки и была обнаружена с помощью анализа Amnis ^® ImageStream ^X Mark II. Анализ проводился с помощью программного обеспечения IDEAS 6.2.

Обнаружение гибели клеток

Для сравнения гибели клеток моноцитов, стимулированных в низкой / высокой [P _i ] среде PI (мертвые клетки) и Hoechst 33342 (все клетки) (Thermo Fisher), использовали окрашивание, а жизнеспособность была проанализирована с использованием общий анализ мертвых с помощью цитометра для визуализации Celigo ^® S (Nexcelom). Моноциты стимулировали в течение 16 часов при 37 ° C / 5% CO ₂ и впоследствии анализировали на их жизнеспособность.

Набор для анализа цитотоксичности ЛДГ Pierce (Thermo Scientific) использовали для анализа гибели клеток в клетках с дефицитом THP-1 CaSR и NLRP3.5 × 10 ⁵ c / w высевали в RPMI1640 / 10% FBS / 50 нг / мл PMA в 24-луночные планшеты для дифференциации за 2 дня до стимуляции. Максимальное высвобождение ЛДГ было обнаружено путем лизиса клеток перед измерением ЛДГ. Анализ проводили, как описано в инструкциях производителя.

Графики и статистика

Прямоугольники на диаграммах с усами указывают на перцентиль 25–75%, в то время как усы показывают минимальные / максимальные значения, а вертикальная линия указывает медианное значение. Гистограммы представляют собой среднее значение + SEM. Значения каждого эксперимента представлены в виде символов в столбцах или на диаграммах-усах.Все графики и статистика были подготовлены с помощью GraphPad Prism 8.0.1. Статистическая значимость определялась с использованием двусторонних непараметрических непарных тестов Манна – Уитни U или парного критерия Вилкоксона или t -теста для выборок размером менее n = 5, доверительный интервал 95%. p — Значения указаны как * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, или ^# p <0.