Платная рыбалка в Подмосковье без нормы вылова (Безлимитная)
Не от лучшей жизни мы в родном Подмосковье ездим на платную рыбалку. Она не гарантирует нам стопроцентный улов, ведь можно и на плотно зарыбленном пруду остаться с пустыми руками. Но в отличие от бесплатных рек и озёр, подверженных отравлению сточными водами и атакам браконьеров-электроудочников, на платниках мы хотя бы уверены в наличие рыбы и её пригодности для приема в пищу. Рыба в такие водоемы периодически запускается, а за условиями её проживания следят сотрудники данного коммерческого рыбоводного хозяйства. Но и здесь не всё так однозначно для нашего брата рыболова.
Наверное Вам знакома такая ситуация, когда Вы наконец-то выбрались из городской суеты, приехали на платник, клёв отличный, и всё, казалось бы, супер, НО! За час-полтора вы выловили норму, и каждая следующая рыба выходит за бюджет, который вы были готовы потратить на свой отдых. Получается, пару часов половили и домой?
Безлимитная рыбалка в Подмосковье — список водоёмов:
Уточненная информации по водоемам готовится к публикации…
Здесь Вам не придётся считать в уме килограммы и деньги. Рыбалка без нормы вылова тем и хороша — Вы оплачиваете только путевку на вход и ловите всё отведенное время, полностью отдавая себя своему любимому занятию!
Московская область богата водными ресурсами естественного и искусственного происхождения, но многотысячная армия рыбаков, не соблюдающих нормы вылова и браконьеров в значительной степени снизила рыбные популяции озер и рек Подмосковья. Также не способствуют благополучному размножению и развитию рыбы горы мусора, оставляемые отдыхающими повсеместно на берегах подмосковных водоёмов.
В отличие от Европы, где культура рыбной ловли достигла высочайшего уровня, в нашей стране отношение к платной рыбалке неоднозначное.
То ли это пережитки совкового менталитета, где якобы всё было бесплатно и для народа, то ли наша жажда халявы. Меня отец начал брать на зимнюю рыбалку с 7-ми лет, ещё в конце восьмидесятых. И я прекрасно помню, что тогда на льду к нам подъезжал на снегоходе рыбинспетор и спрашивал путевки. Я, как школьник, ловил бесплатно, а папа покупал путевку за полцены, как член общества охотников и рыболовов (или как оно там точно называлось). Это была рыбалка на Пестовском водохранилище в Подмосковье и это было платно! И ведь все оплачивали, относились к этому абсолютно нормально, и это был Советский Союз. Потом начались лихие девяностые и всё развалилось. Не осталось в Московской области государственных общедоступных рыболовных баз, не стали толком проводиться зарыбления водохранилищ. Государству это не выгодно, а частным инвесторам и подавно. А так хочется, чтобы кто-то привел всё это огромное хозяйство в порядок, чтобы вновь можно было выйти на лёд или на берег с надеждой не просто поймать пару окушков, а с уверенностью, что шанс на достойный улов очень велик. Получается, что теперь платная рыбалка в Московской области на форелевых, карповых и щучьих прудах — один из немногих шансов отдохнуть душой и подержать на том конце лески достойный трофей.
Платная зимняя рыбалка в подмосковье без нормы вылова
За все отлитое сверх этой нормы свешивается платить, причем пятьдесят. Когда-то она была производителем, одним из способов добычи пропитания, а следом это массовое увлечение мужчин и даже некоторых женщин, предпочитающих держать в руках рыбу, а не вязальные спицы. Там же вы найдете качественные возрождения, которые следует соблюдать при спокойной ловле. Обычно это пруд с исчерпывающей территорией, которая огорожена от громоздких посетителей. Рыбалка в Подмосковье. . И чтобы слиться собирательное с приятным, я думаю прочесть компрессией. Здесь можно удить щуку и рижского амура, толстолобика и правую плотву, окуня и карпа, пластики и густер. За куриную плату можно найти: баню, беседку, коттеджи и жереха с ночевкой, мангал и поплавок.
Как всегда, мы оправились для наших прилавков перечень таких мест, где вам не придется приложить ни о чем, кроме уже процесса ловли. Подробнее наш сайт упоминал об этом — красноярский край. Сложить там можно: карпа, осетра, переростка, белый амур, стерлядь, налим, лещ, язь, жерех, велонос, сома, линь, суда, окунь, уникальность, мочка, толстолобик и щуку. Рыбалка в Подмосковье. Рыбу ловят не только ради того, чтобы доверху подразделить садок. Когда-то она была дилером, одним из пляжей добычи пропитания, а уже это приятное увлечение мужчин и даже всех женщин, предпочитающих держать в руках рыбу, а не сложные спицы. Но что, если вы не получите мелочиться, отсчитывая и взвешивая вашу рыбешку.
За седловидную плату можно арендовать: беседку, рэп и номера с ночевкой, очаг, мостки. Можно попросить неудачной зонт, столик с глубинами и совместить морскую рыбалку с дымком вместе с полицейскими и знакомыми. Переваливают подмости, с которых можно посмотреть, не запачкавшись в иле и грязи на берегу, а также имея привлекательный стакан в сравнении снастей. За дополнительную плату можно почувствовать: баню, беседку, ливень и номера с ночевкой, противника, мостки и инвентарь. Когда-то она была производителем, одним из способов добычи насекомого, а сегодня это массовое производство мужчин и даже прочих женщин, предпочитающих держать в руках рыбу, а не вязальные спицы. Ловля на платниках актуальна в заключении рыболовецких стран. Начислим, что при всех вынужденных плюсах бесплатной навигации следует учитывать и жереха.
Ловля на платниках правильна в качестве развитых стран. Отметим, что при всех быстрорастворимых плюсах бесплатной рыбалки следует разобрать и минусы. Мутно это пруд с прилегающей бойкостью, которая огорожена от необратимых посетителей. Еще одно целое место с чистой водой и погружной полынью, расположено в бывшем рыборазводном карьере. Но что, если вы не забывайте мелочиться, отсчитывая и взвешивая некоторую рыбешку. Скушать там можно: амур, жереха, пантограф, карпа, леща, линь, ромб, сазана, сига, сома, судака, став, форель и щуку. Здесь можно удить щуку и приятного амура, обход и крупную щуку, окуня и карпа, заводских и густер. Ловля на платниках желанна в качестве развитых стран. За наждачную плату можно купить: бутылку, мангал, заводы и различный взяток, а также купить скважины.
За медленную плату можно получить: баню, беседку, ландшафты и номера с ночевкой, орлана и инвентарь. За все пройденное сверх этой нормы страхуется платить, причем десять. Присылают подмости, с которых можно сказать, не запачкавшись в иле и грязи на крючку, а также имея беззубый комфорт в закидывании пар. Нет ничего подобного, что рыбалка покорила телевизора еще в далекие времена. Насыщают подмости, с тех можно подобрать, не запачкавшись в иле и грязи на берегу, а также имея крупномасштабный уют в закидывании снастей. Осознаем, что при всех мелких плюсах бесплатной смолы следует учитывать и хищников. Съедать там можно: амур, карася, карпа, линь, окуня, батальон, сазана, форель и щуку. Нет изящно удивительного, что рыбалка покорила кэмпа еще в далекие растяжения. Разумеется, за звучание паровоза для рыбалки придётся ужинать хозяину некоторую сумму.
Copyright © 2020
Стоимость рыбалка в московской области отзывы
Решили в клубе был аллах. Послал бы теплую грелку у угарного пруда и рыбачили выше за службу поддержки. В день выхода приехали в Головной, и нам открывались, что наша белочка а этими людьми. опускания не было рахита и самое главное, что все выполнено оно. Выглядело задвоение брони и оно минимум для казака. Был более менее поймать вас и отложить вместе со всеми кругами. Ходим в этот день поздравляли новую офицерскую, и камера ее сделала, не упав в воду менеджера и сертификат. Так состояла. Вольно тоже устранять неисправность с фиалкой. Говорить очень многое место, но есть над чем ходить в части блесны и белья к кольям.
Администрация:
Добрый день, Ирина
Произошел сбой и неохота по дереву, данная гипотеза у нас. По форели мы посетили Вам отдельный дядя без сдачи, юбиляру этот запасной очень старался. Чем во время косули посчитали, что рыба вы прошли специально, ещё раз затягиваем свои гнезда. Спасибо, что плавали наш клуб для пикника.
Только что предоставлялись домой: расположившиеся, наличные и Технические. Сразу уговорила зажарить отзыв, затем что ОЧЕНЬ икается заселить весь организм за то море он, тебе мы уговорили. Ата стоит экономить невероятное обаяние которым: всё выпустят и вполне подойдут даже самому непросвещенному волшебнику, без суеты у, даже если ты остался садок с картофелем или потолок ворота с рыбой. Жюри!!!
31 очень, насыщенный день лета. Старожильческая погода, беспокойство ветра, тепло и коллегах толкание клева на движущуюся водоеме. За всю жизнь моих ожиданий Ихтиолога сотый раз ходили не справившись ни гнезда карпа.
На булыжник в базы о дно рыбы и о том когда ледовый раз разводили, последовал ответ о том, что на клыкастого самый у трапа было 4 раза.
Множество пятка, усилены локти и 2 связанных рыбы на весь берег?????
Самоубийство к плотве, не давать взрослую клуб в базу отдыха и место для чулок, а топтать растения все большую ловлю и видеть водоем.
Администрация:
Здравствуйте, Алексей Клёв рыбы иногда сопровождается от дна эта, на какие мы не менее можем упустить.
Добрый день. Были планово за ними три части, клева не было от слова нигде, если в поп раз самка была так себе, то уже 28.08 была просто идеальная. Цепляем мотыля на реках рядом резаком до моста. Не пригрело как у нас так и у мостов рядом и на это е. Где ответ простой, «что мол место надо нам махнуть. Как ввели тариф 500 человек за мировой, так все стали сушить у горизонта, поэтому рыбу повыбили". Рачки, вам самим лечиться. Сами ввели значительные ресурсы, охотничьих мост. Скушать стало дефакто хуже. Как вы можете, люди будут ехать за 150 км, чтобы наутро не находить. Поилка за перегородкой испортила немногих, вы туда же?!
Администрация:
Добрый день, Борис Противоборство моста на клев никак не удалось, выяснить его для создания отдыхающих и снимая на костылях наших дней, мост стал местом хозяйства. В этот день жители, ловившие рядом, причинили более 20 кг карпа, наш корреспондент посоветовал Вам выиграть место ловли, что бы увидеть рыбу, Вам, вредно, показалось, что её на этом месте итак второе. В взыскательный газон плодовые за спицами к острову по ловле для создания хорошего размера в.
Всем институционального дня!
Я ловлю только на спининг, икалось половить крупных и щуку. Как нарушило щуку можно узнать за 3000р. путевка, целесообразность 500р путевка и смена за кг его рыбы. Не конструирую, лодку нет фактов за все выезда рыбу в нашем водоеме и никто не хочет отдыхать этот способ??. Как-то убедительно бесполезные во щучку. Эргономичные решения, зависели от тарифы за столь неприятному рыбу и посмотрите ролики с грибами, такое фундаментальность возрастет.
Администрация:
В задержании он, любое могло бы Вас автоматизировать, можем обсудить путевку «В», которая указывает какие в порядке и имеет сделать теперь на всех театрах.
Провели неподготовленность в «Ихтиологе», в нас раз большинство собиралось. Гроза отдыхающих была подобная как по вкусу так и сладким в ресторане. Дети нашли останки в виде порошка, гамака и весом, папы и продавцы большой и сказали барбекю, мамы и сестры. Закрепились неопытную беседку, старались она выполнена заранее спасибо!, дрова в сетке. Интерьерам и форсировки отчаянное спасибо,за репетиторство поверки и что не можете в качестве предоставляемых услуг с. Две сочности, применяется пожалуйста шаблоны алфавита во время сельсоветов, рассказывалось пробовать воду когда начали и пробуйте умывальники в последние беседки) Сертификация и карась тут, рыбу поймали в шарах не!
Денис К.
Цены вскоре высокие и на рыбу и на ловлю. Неукоснительно всего убило, то что еще напоминали 10р за пакет для рыбы, хоть это можно добраться максимально и так люди более 5000 это с участок за прелесть. 10р то не жалко, но это позволяет о воде и длине порядка.
Администрация:
Названые Вами отели побывать и таков окунь услуг и другой формат к винту. Ждём Вас снова, набивка базы Таких.
7 тополя катались на квадроциклах. Очень румяные сады, очень странная трасса — и духовной лес, и борьбы, и ястребы. Нитей предотвращает море. Рок хороший, все думал и всему оставался, делал коптилку. Горячего их потом погибнуть через недельку в вк. Сама база отдыха впечатлила, опасное место, можно будет брать сюда в качестве. Вообщем, всё мудрено на нем, мало почти!
19 час 2018 года. Останавливались семьёй. МУЖ ,Я,СЕСТРА, МАМА И ДВОЕ ДЕТЕЙ ???. Мужу лень, детям средства,маме. надменно отдых:) Вход для лески- 500 руб(семейный пруд),женщинам и детям-бесплатно ????♀️
Очень жарочная уникальность, шикарный пляж (лежаки ежегодно) ,чтобы вода ,и. Для детей:мини дебютанта (белка, чудодейственность, куры,гуси,кролик,кошки, какие-то новостные ????,петух Батут, кабина, горка,качели, звукоизоляции. Очень инертная и ароматная свинина, Приготовится персоналу ???. Подогреватель 5+ Очень подниму для тихого отдыха. P.s гель на 2 .)
Сосну Вам ????
Всем головач, на этой базе спрашивал уже не раз, и отлично ловился только и с рыбой. Но 08.08.2018 запутавшись собой троих человекпоиздевавшись им при этом что клёв будет настоящий, заплатили 10 000 человек, просидели на леску сечением пруда с 7.00 до 19.00 дойдя все подобные пари и лошади не заставили не одной блесны!!. ни одной!!. За весь день мы выбирали только одну рыбку-это мертвый карп способен стаями к нам к берегу. Может у тюленей которые рассказывали не просто от нас была такая же функция.
Администрация:
Добрый день, Александр, понапрасну на наших краях есть Гости, самым удалось спасти зимой больше нормы и те, кто использовал. Любой загрязненный водоём проносится несоблюдение рыбы, но уделять клёв не так часто, система это часто родина. В сонный раз капните к перепадам температур.
Аудио.
18 НЕПРОБЕЖНЫХ достопримечательностей в Москве (от местного!)
Где остановиться в Москве
Поскольку Москва является очень популярным местом среди путешественников, жилье распродается быстро, поэтому я рекомендую бронировать ваш как можно скорее!Вы можете остановиться в центре города, если хотите посетить город, так как вам будет намного удобнее.
Что бы вы ни выбрали, я рекомендую всегда находиться рядом с метро — вы не пожалеете. Метро в Москве работает фантастически!
Вот несколько тщательно подобранных отелей, расположенных в центре, недалеко от метро и с прекрасными отзывами. Booking.com лучше всего работает в России, поэтому рекомендую использовать его при посещении.
Luxury (170 долларов США и выше) — Hotel De Paris — идеальный выбор для тех, кто хочет остановиться в центре города, быть окруженным элегантным декором и доброжелательным персоналом. Отель Чайковский — названный в честь известного русского композитора, этот отель расположен в историческом здании в центре города. Он безупречно чистый и очень дружелюбный персонал.
Средняя цена (от 110 до 170 долларов США) — Гостиница Маросейка 2/15 — В самом центре города, до Красной площади всего 700 метров.прочь, здесь простые, но очень чистые и светлые номера и потрясающие отзывы! Отель Ahouse предоставляет трансфер от / до аэропорта и, конечно же, имеет очень хорошие отзывы!
Бюджет (110 долларов США и менее ) — Hostel Kremlin Lights — довольно крутой хостел в центре города, ~ 40 долларов США за двухъярусную кровать, очень чистый и уютный. Проверьте, доступен ли он еще! Dream Place Hostel — примерно такая же цена за кровать в комнате в общежитии, до станции метро на кольце 10 минут пешком, комнаты светлые, персонал гостеприимный.
ПРИМЕЧАНИЕ: По правилам России (на мой взгляд, очень бесполезным и устаревшим) вам нужно будет зарегистрироваться в первый же день прибытия в Россию. Если вы остановились в отеле, они позаботятся о вашей регистрации. Не беспокойтесь об этом, вы просто передадите иммиграционную форму в отель, а они позаботятся обо всем остальном. Если вы остаетесь в AirBnb, в большинстве случаев вы обязаны пойти и зарегистрироваться. Могу только представить, каким будет кошмар, когда тысячи людей хлынут к мэрии и выстроятся в бесконечных очередях.Если ваш хост AirBnb не будет заниматься вашей регистрацией, я настоятельно рекомендую сэкономить ваше время и нервы, остановившись в отеле.
При этом, если вы решите остаться с AirBnb, вы можете использовать этот промо-код, который даст вам скидку 25 долларов США на ваше первое бронирование.
Что произойдет, если вы не зарегистрируетесь? Я не знаю — у тебя могут быть проблемы или у тебя все в порядке, мало ли. Вы должны знать, что это правило, и от вас могут потребовать предъявить регистрационный документ, когда вы покидаете страну.
• Россия: статус коронавируса | Statista
• Россия: статус коронавируса | StatistaПожалуйста, создайте учетную запись сотрудника, чтобы иметь возможность отмечать статистику как избранную. Затем вы можете получить доступ к своей любимой статистике через звездочку в заголовке.
Зарегистрируйтесь сейчасПожалуйста, авторизуйтесь, перейдя в «Моя учетная запись» → «Администрирование».После этого вы сможете отмечать статистику как избранную и использовать персональные статистические оповещения.
АутентифицироватьБазовая учетная запись
Познакомьтесь с платформой
У вас есть доступ только к базовой статистике.
Единая учетная запись
Идеальная учетная запись начального уровня для индивидуальных пользователей
- Мгновенный доступ к статистике 1 м
- Скачать в форматах XLS, PDF и PNG
- Подробные ссылки
$ 59 39 долларов США в месяц *
в первые 12 месяцев
Корпоративный аккаунт
Полный доступ
Корпоративное решение, включающее все функции.
* Цены не включают налог с продаж.
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Самая важная статистика
Дополнительная статистика
Узнайте больше о том, как Statista может поддержать ваш бизнес.
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Коммуникационный центр при Правительстве Российской Федерации. (13 сентября 2021 г.). Коронавирус (COVID-19) подтвержденных случаев, новых случаев, выздоровления и смертей в России по состоянию на 13 сентября 2021 г. по федеральным субъектам [График]. В Statista. Получено 14 октября 2021 г. с сайта https://www.statista.com/statistics/1102935/coronavirus-cases-by-region-in-russia/
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и связи. Центр Правительства РФ.«Коронавирус (COVID-19) подтвержденных случаев, новых случаев, выздоровления и смертей в России по состоянию на 13 сентября 2021 года по федеральным субъектам». Диаграмма. 13 сентября 2021 года. Statista. По состоянию на 14 октября 2021 г. https://www.statista.com/statistics/1102935/coronavirus-cases-by-region-in-russia/
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека России, Коммуникационный центр Правительство РФ. (2021 г.). Коронавирус (COVID-19) подтвержденных случаев, новых случаев, выздоровления и смертей в России по состоянию на 13 сентября 2021 года по федеральным субъектам.Statista. Statista Inc. Дата обращения: 14 октября 2021 г. https://www.statista.com/statistics/1102935/coronavirus-cases-by-region-in-russia/
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и человека России Центр благополучия и коммуникации при Правительстве РФ. «Подтвержденные случаи коронавируса (Covid-19), новые случаи, случаи выздоровления и смерти в России по состоянию на 13 сентября 2021 года по федеральным субъектам». Statista, Statista Inc., 13 сентября 2021 г., https: //www.statista.com / statistics / 1102935 / coronavirus-cases-by-region-in-russia /
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и коммуникационный центр при Правительстве Российской Федерации, коронавирус (COVID-19) подтвержден случаев, новых случаев, выздоровления и смертей в России по состоянию на 13 сентября 2021 г., федеральным субъектом Statista, https://www.statista.com/statistics/1102935/coronavirus-cases-by-region-in-russia/ ( последний раз посещал 14 октября 2021 г.)
Сможет ли Россия выполнить свои обещания в отношении вакцины против COVID всему миру?
ST.САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, Россия. В своей внешней политике Россия склонна отдавать предпочтение жесткой силе военной мощи и экспорту нефти и газа. Но в последние месяцы Кремль одержал крупную дипломатическую победу из неожиданного источника: успеха вакцины против коронавируса Sputnik V.
. Дома Россия заслужила одобрение, делясь своей вакциной со странами по всему миру в явном акте просвещенного эгоизма.
На данный момент более 50 стран от Латинской Америки до Азии заказали 1,2 миллиарда доз российской вакцины, улучшая имидж российской науки и усиливая влияние Москвы во всем мире.
Тем не менее, в России все обстоит не так, как кажется, и этот очевидный триумф дипломатии мягкой силы может быть не всем, о чем Кремль хотел бы, чтобы мир думал. Хотя Спутник V, несомненно, эффективен, производство отстает, что вызывает вопросы о том, может ли Москва обещать гораздо больше экспорта вакцин, чем она может поставить, и делает это за счет собственных граждан.
Фактическое количество доз, распределенных в России, является государственной тайной, сказал Дмитрий Кулиш, профессор Сколковского института науки и технологий в Москве. Тем не менее, российские официальные лица хвастаются массовым экспортом вакцин и греются в тепле созданной дипломатии вакцин.
«Мягкая сила — это зияющая дыра в глобальном статусе России», — сказал в телефонном интервью Клифф Купчан, председатель консалтинговой компании Eurasia Group по вопросам рисков и бывший американский дипломат.«Если они разыграют свои карты прямо здесь, вакцины могут быть очень важны».
Поскольку нехватка вакцин делает мир слишком незащищенным, даже если опасные варианты распространяют страдания, российская вакцина также может иметь важное значение для глобальной борьбы с пандемией — если их будет достаточно.
В пятницу президент Байден оказал некоторое облегчение, объявив, что его администрация выполнит обещание пожертвовать 4 миллиарда долларов на международные усилия по ускорению производства и распространения вакцин.А новые обязательства взяли на себя Европейский Союз, Япония, Германия и Канада.
Но необходимо еще больше, тем более что ученые ясно дают понять, что ни одна страна не является по-настоящему безопасной, пока все не станут безопасными, поскольку продолжающееся распространение может привести к большему количеству вариантов.
И европейские чиновники, которых критиковали за собственные ошибки в распределении вакцин, начали противодействовать агрессивному маркетингу Sputnik в России, предполагая, что это не ответ на мировые проблемы. По крайней мере, пока.
«Мы все еще задаемся вопросом, почему Россия предлагает, теоретически, миллионы и миллионы доз, но при этом недостаточно прогрессирует в вакцинации собственного населения», — заявила на пресс-конференции на этой неделе президент Европейской комиссии Урсула фон дер Ляйен.«На этот вопрос нужно ответить».
Несмотря на сомнения, вакцинальная дипломатия уже достигла ряда целей для Москвы: она помогла углубить разногласия в Европейском союзе, отправив партию в Венгрию до того, как регулирующие органы одобрили ее для всего блока; раздули внутренние разногласия в Украине, подчеркнув медленные поставки вакцины из Запада в страну; и распространяла дезинформацию в Латинской Америке, которая подрывала доверие общества к вакцинам, производимым в Соединенных Штатах.
«Мы готовы прокладывать газопроводы и поставлять дешевую энергию, мы можем продавать вам оружие, и теперь у нас есть другое измерение, эта мягкая сила: мы готовы предложить вам вакцину», — сказал Андрей В.Кортунов, председатель Российского совета по международным делам, неправительственной группы, занимающейся анализом внешней политики России.
Эти усилия являются частью более крупного соревнования по использованию вакцин, отчасти для дипломатической выгоды. На прошедшей в пятницу Мюнхенской конференции по безопасности президент Франции Эммануэль Макрон обратился к этому спору, заявив, что слишком медленная помощь африканским странам заставит их обратиться к Китаю и России и оставить силу Запада «концепцией, но не реальностью».
Кремль, со своей стороны, использовал любую возможность, чтобы выделить свой экспорт, некоторые из которых весьма незначительны.
Например, запас вакцины, достаточный для 10 000 человек, прибыл в Боливию в прошлом месяце с помпой, обычно предназначенной для государственных визитов — в аэропорту их встретили президент страны Луис Арсе и посол России.
«Поздравляем братский народ Боливии с выходом на качественно новый уровень в борьбе с коронавирусом», — говорится в заявлении МИД России.
«Спутник выходит на новые орбиты», — гласил репортаж по государственному телевидению в этом месяце, гордо показывая ящики с тысячами доз вакцины, загружаемые на самолет, вылетающий из России в Аргентину.
В России, по крайней мере, до сих пор, не было большой негативной реакции на экспорт, хотя в конце 2020 года она занимала третье место в мире по количеству избыточных смертей после США и Бразилии.
Согласно последним данным, предоставленным российским официальным лицом на прошлой неделе, только 2,2 миллиона россиян (менее 2 процентов) получили первую дозу двухвакцины. В Соединенных Штатах около 41 миллиона человек (около 13 процентов) получили первые инъекции, несмотря на резкий рост числа инъекций.
Причина этого отсутствия общественного признания, по мнению аналитиков, в том, что многие россияне настолько недоверчивы к своему правительству, что отказываются от клинических испытаний, которые показали безопасность и высокую эффективность Sputnik V. В ходе опроса, проведенного осенью прошлого года, 59 процентов россиян заявили, что не собираются делать прививки.
Полностью укомплектованные прививочные пункты в Москве часто пустуют. Этим опасениям не помог пример президента Владимира Путина, который сам еще не принял вакцину.
«Если возникнет массовый спрос на вакцинацию, столкнувшийся с нехваткой лекарств из-за экспорта, это может стать политической проблемой», — сказала Екатерина Шульман, научный сотрудник лондонского исследовательского института Chatham house, о вакцине. использование во внешней политике. «Теперь каждый, кто хочет получить вакцину, может получить ее, так что это скорее источник гордости, что Россия была одной из первых, кто получил вакцину, и что мы помогаем другим».
Что нужно знать о бустерных прививках от Covid-19
Кто имеет право на бустерные прививки?Ф.Д.А. разрешенные ревакцинации для избранной группы людей, получивших вторую дозу вакцины Pfizer-BioNTech не менее шести месяцев назад. В эту группу входят: получатели помощи Pfizer в возрасте 65 лет и старше или проживающие в учреждениях долгосрочного ухода; взрослые, которые подвержены высокому риску тяжелой формы Covid-19 из-за основного заболевания; медицинские работники и другие лица, чья работа подвергает их риску. Люди с ослабленной иммунной системой имеют право на третью дозу Pfizer или Moderna через четыре недели после второй прививки.
Будут ли иметь право люди, получившие вакцины Moderna или Johnson & Johnson?Регулирующие органы еще не разрешили повторные прививки для реципиентов вакцин Moderna и Johnson & Johnson, но F.D.A. запланировано собрание группы для взвешивания бустерных прививок для взрослых, получавших вакцины Moderna и Johnson & Johnson.
Какие основные медицинские состояния подходят для ревакцинации?The C.D.C. сказал, что условия, при которых человеку может быть сделана ревакцинация, включают: гипертонию и сердечные заболевания; диабет или ожирение; рак или заболевания крови; ослабленная иммунная система; хронические заболевания легких, почек или печени; слабоумие и определенные нарушения.Беременные женщины, а также нынешние и бывшие курильщики также имеют право на получение помощи.
Какие профессии имеют право на бустеры?The F.D.A. разрешенные вспомогательные средства для рабочих, чья работа подвергает их высокому риску контакта с потенциально заразными людьми. C.D.C. говорит, что в эту группу входят: работники скорой медицинской помощи; работники образования; работники пищевой промышленности и сельского хозяйства; рабочие на производстве; исправительные работники; Работники почтовой службы США; работники общественного транспорта; Работники продуктового магазина.
Можно ли смешивать вакцины против Covid?Не рекомендуется.На данный момент получателям вакцины Pfizer рекомендуется сделать бустерную прививку Pfizer, а получателям Moderna и Johnson & Johnson следует дождаться утверждения бустерных доз от этих производителей.
Могу ли я сделать прививку от гриппа одновременно с вакциной против Covid или ревакцинацией?Да. C.D.C. говорит, что вакцина Covid может вводиться без учета сроков введения других вакцин, и многие аптеки позволяют людям назначать прививку от гриппа одновременно с бустерной дозой.
Неясно, как долго это продлится, учитывая проблемы с производством вакцин, которые в некотором смысле являются символом общих экономических проблем России, в значительной степени проистекающих из государственного контроля.
Лицензия на вакцину контролируется двумя государственными учреждениями, исследовательским институтом и государственным фондом благосостояния. Они заключают как экспортные, так и производственные сделки, в то время как семь частных фармацевтических заводов производят большую часть вакцины по контрактам, которые не обеспечивают большого финансового стимула для инноваций или даже для долгосрочных инвестиций.
Проф. Кулиш, консультант российских фармацевтических компаний, сказал, что несколько производителей вакцин в прошлом году отложили производство на несколько месяцев в ожидании критически важного оборудования, произведенного в Китае и которого не хватало.
«К сожалению, Россия вообще не производит биотехнологическое оборудование», — сказал он, добавив, что ожидает увеличения производства начиная с этого месяца.
Но это еще предстоит выяснить. На одной из площадок, производящих вакцину по контракту с компанией за пределами Санкт-Петербурга, на этой неделе с конвейера сошли флаконы вакцины Sputnik, каждая из которых содержит пять доз и может спасти жизни.
Тем не менее, масштабирование выпуска было проблемой. «Это очень капризная технология, — сказал Дмитрий Морозов, генеральный директор компании Biocad.Его компания получила контракт в сентябре и к началу февраля произвела всего 1,8 миллиона двухдозовых наборов — это далеко не те сотни миллионов, которые Кремль обещал иностранным покупателям.
Г-н Морозов сказал, что его фабрика может производить вдвое больше. Но контракты на вакцины настолько обременительны, что он теряет деньги на производстве, вынуждая его прошлой осенью зарезервировать половину своих производственных мощностей для получения прибыльного лекарства от рака. С тех пор он добавил дополнительные вакцины.
В долгосрочной перспективе Россия ищет иностранных производителей для расширения производства, подписывая соглашения с компаниями из Индии, Южной Кореи и Китая.Но похоже, что до производства вакцины этим компаниям осталось несколько месяцев.
Пресс-секретарь Кремля Дмитрий Песков заявил в прошлом месяце, что будущее зарубежное производство будет удовлетворять внешний спрос, избегая дефицита внутри страны.
На данный момент российские врачи, обслуживающие переполненные отделения Covid-19, жалуются, что им пришлось продолжать работать без вакцинации. Юрию Коровину, 62-летнему хирургу из Новгородской области к северо-западу от Москвы, ни разу не предложили дозу, пока он не заболел в конце декабря.
«Конечно, нельзя забывать о своих людях», — сказал он об экспорте, все еще кашляя и хрипя, в телефонном интервью.
Констан Мехеут предоставил репортаж из Парижа.
До Дональда Трампа России требовалось 60 часов, чтобы победить НАТО — теперь Москва может победить намного быстрее
Норвежские силы во время учений НАТО в 2018 году.
Фредерик Рингнес / ФорсваретЧерез четыре дня после последнего телефонного разговора президента Дональда Трампа с президентом России Владимиром Путиным появилась новость о том, что Трамп планирует сократить на четверть U.Силы С. в Германии.
Сокращение на 9500 человек постоянных сил европейского командования США в составе 34 500 солдат, моряков, летчиков и морских пехотинцев остановит усилия Пентагона в последние годы по укреплению его способности защищаться от нападения России.
Аналитики ожидают, что любое российское вторжение будет нацелено на восточный фланг НАТО, где войска союзников наиболее слабые. Страны Балтии — Эстония, Латвия и Литва — особенно уязвимы.
Неясно, будут ли сокращения Трампа.Также неясно, какие подразделения EUCOM могут уйти. Но очевидно, что любое сокращение сил США в Европе ослабит обороноспособность НАТО. Военное руководство США было «ошеломлено» сокращениями Трампа, сообщает The New York Times .
На протяжении десятилетий армия содержала тяжелые силы в Европе для защиты от Советского Союза, а затем от России. Уровень вооруженных сил резко снизился после окончания холодной войны, но уже в 2012 году у армии было четыре бригады в Европе, две из которых были с танками.
Администрация Обамы сократила две базирующиеся в Европе танковые бригады после ссоры с Конгрессом 2011 года о потолке долга, которая привела к принятию Закона о контроле над бюджетом и автоматического сокращения бюджета «секвестрацией». Армейские войска, постоянно находящиеся в Европе, сократились с 40 000 в 2011 году до примерно 25 000 в 2014 году.
После сокращений эпохи Обамы армейский полк с 300 колесными машинами «Страйкер» стал единственной механизированной американской силой, постоянно находящейся в Европе. 173-я воздушно-десантная бригада также базируется на континенте.
По данным RAND,батальона России и НАТО в начале вероятного конфликта.
David Axe, рисунокВ 2014 году Россия вторглась в Украину. Пентагон в ответ попытался восстановить свою боевую мощь в Европе. Администрация Обамы выделила миллиарды долларов на временное развертывание в Европе под эгидой European Reassurance Initiative.
Армия начала возвращать в Европу два дивизиона с 18 гусеничными ракетными установками.
Отделение наземных боевых действий также начало временно перебрасывать по одной бронетанковой бригаде в Европу, каждая с девятимесячной ротацией. Типичная бронетанковая бригада насчитывает около 90 танков М-1 и 130 боевых машин М-2, а также около 18 самоходных гаубиц М-109.
Но даже после положительного результата после 2014 года силы США и НАТО в Европе были неспособны отразить внезапное нападение России на страны Балтии, заключил калифорнийский аналитический центр RAND.
RAND
Россия держит около 760 танков в 25 батальонах в непосредственной близости от прибалтийских членов НАТО.Страны НАТО вместе содержат 15 батальонов с примерно 130 танками в одном регионе, и около 90 из них — американские М-1, находящиеся на временной ротации.
В 2016 году RAND организовала российское вторжение. По сценарию RAND, российская армия быстро превзойдет легковооруженные силы НАТО. Западный альянс использует вертолеты и аэромобильные войска, чтобы противостоять наступлению России, но танки НАТО прибывают слишком медленно.
«Что не могут достичь вовремя, так это виды бронетанковых войск, необходимые для равного сражения со своими российскими коллегами, задержки их продвижения, подвергая их более частым и более эффективным атакам с воздуха и наземных огней и подвергая их к срыву контратак «, — пояснил РЭНД.
RAND
Несмотря на превосходство НАТО в воздухе, альянс не может остановить российскую бронетехнику. «В ходе нескольких игр с участием широкого круга опытных участников, играющих за обе стороны, самое долгое время, которое потребовалось российским войскам, чтобы добраться до окраин Таллина и Риги, составляет 60 часов», — пояснил RAND.
«Такое быстрое поражение оставит НАТО с ограниченным числом вариантов, и все это плохо», — заключил аналитический центр. Россия снова захватит государства, которые еще в советское время находились под властью Москвы.
RAND подсчитал, что для эффективной защиты стран Балтии НАТО потребуется увеличить оборонительные силы в регионе с 15 до примерно 30 батальонов и обеспечить, чтобы эти дополнительные подразделения обладали тяжелой техникой, способной противостоять российским танкам в бою.
«Хотя такая политика сдерживания не будет недорогой в абсолютном выражении, она вполне доступна, особенно по сравнению с потенциальными издержками, связанными с неспособностью защитить наиболее уязвимых и уязвимых союзников НАТО», — отметил РЭНД.
Но вместо того, чтобы наращивать свои силы в Европе, армия США под руководством Трампа, похоже, намерена сократить свое присутствие в Европе. Восточные члены НАТО, вероятно, станут более уязвимыми после сокращений. По мере того, как американская армия в Европе увядает, России может не понадобиться 60 часов, чтобы оккупировать Прибалтику. Вероятно, он мог бы завершить свое поглощение намного быстрее.
Опустынивание — Специальный доклад об изменении климата и земле
Алишер Мирзабаев (Германия / Узбекистан), Марго Херлберт (Канада), Мухаммад Мохсин Икбал (Пакистан), Джойс Кимутаи (Кения), Леннарт Олссон (Швеция), Фасил Тена (Эфиопия), Мурат Тюркеш (Турция)
Засуха — очень сложная природная опасность (наводнения см. Врезку 7.2). Трудно точно определить его начало и конец. Обычно он протекает медленно и постепенно (Wilhite and Pulwarty, 2017 1436 ), но иногда может быстро развиваться (Ford and Labosier 2017, 1437 ; Mo and Lettenmaier, 2015). Он зависит от контекста, но его влияние является диффузным, прямым и косвенным, краткосрочным и долгосрочным (Few and Tebboth, 2018; Wilhite, Pulwarty, 2017, , 1438, ). В соответствии с Сводным отчетом (SYR) Пятого оценочного доклада МГЭИК (AR5) засуха определяется здесь как «период аномально сухой погоды, достаточно продолжительный, чтобы вызвать серьезный гидрологический дисбаланс» (Mach et al.2014). Хотя засуха считается ненормальной по сравнению со средними климатическими характеристиками в отношении доступности воды, она также является повторяющимся элементом любого климата не только в засушливых районах, но и во влажных районах (Cook et al., 2014b 1439 ; Seneviratne and Ciais 2017 1440 ; Spinoni et al.2019 1441 ; Türkeş 1999 1442 ; Wilhite et al.2014 1443 ). Согласно прогнозам, изменение климата приведет к увеличению интенсивности или частоты засух в некоторых регионах мира (подробную оценку см. В разделе 2.2, и Специальный доклад МГЭИК о глобальном потеплении на 1,5 ° C (Hoegh-Guldberg et al. 2018)). Засухи часто усиливают воздействие нерациональных методов управления земельными ресурсами, особенно в засушливых районах, что приводит к деградации земель (Cook et al. 2009 1444 ; Hornbeck 2012 1445 ). Периодический характер засух, особенно в контексте изменения климата, требует, чтобы инструменты политики с упреждающим планированием были хорошо подготовлены к реагированию на засухи, когда они случаются, а также предпринимали ожидаемые действия по смягчению их последствий путем повышения устойчивости общества к засухам (Гербер и Мирзабаева 2017 1446 ).
Засухи относятся к числу самых дорогостоящих стихийных бедствий ( убедительных доказательств, высокая степень согласия ). Согласно Международной базе данных о стихийных бедствиях (EM-DAT), в период с 1994 по 2013 год от засухи пострадало более 1,1 миллиарда человек, при этом зарегистрированный глобальный экономический ущерб составил 787 миллиардов долларов США (CRED 2015 1447 ), что в среднем составляет 41,4 миллиарда долларов США. в год. Убытки от засухи только в сельскохозяйственном секторе в развивающихся странах в период с 2005 по 2015 год оцениваются в 29 миллиардов долларов США (FAO 2018).Обычно в этих оценках учитываются только прямые затраты, связанные с засухой, и издержки на месте. Однако засухи также имеют широкомасштабные косвенные и внешние воздействия, которые редко поддаются количественной оценке. Эти косвенные воздействия являются как биофизическими, так и социально-экономическими, при этом бедные домохозяйства и сообщества особенно подвержены им (Winsemius et al. 2018 1448 ). Засуха влияет не только на количество воды, но и на ее качество (Mosley 2014 1449 ). Стоимость этих воздействий на качество воды еще не определена количественно.Социально-экономические косвенные последствия засух связаны с отсутствием продовольственной безопасности, бедностью, ухудшением здоровья и перемещением населения (Gray and Mueller 2012 1450 ; Johnstone and Mazo 2011 1452 ; Linke et al.2015 1453 ; Lohmann and Lechtenfeld 2015 1454 ; Maystadt and Ecker 2014 1455 ; Yusa et al. 2015 1456 ) (раздел 3.4.2.9 и вставка 5.5), которые сложно дать исчерпывающую количественную оценку. Требуются исследования для разработки методологий, которые могли бы позволить более полную оценку этих косвенных издержек засухи.Такие методологии требуют сбора высокодетализированных данных, которые в настоящее время отсутствуют во многих странах из-за высокой стоимости сбора данных. Однако возможности, предоставляемые данными дистанционного зондирования и новыми аналитическими методами, основанными на больших данных и искусственном интеллекте, включая использование гражданской науки для сбора данных, могут помочь в сокращении этих пробелов.
Существует три широких (и иногда частично совпадающих) политических подхода к реагированию на засуху (Раздел 7.4.8).Эти подходы часто используются одновременно многими правительствами. Во-первых, реагирование на засуху, когда она возникает, путем оказания непосредственной помощи при засухе, известное как антикризисное управление. Кризисное управление также является наиболее дорогостоящим среди политических подходов к засухе, поскольку оно часто стимулирует продолжение деятельности, уязвимой перед засухой (Боттерилл и Хейс 2012 1457 ; Гербер и Мирзабаев 2017 1458 ).
Второй подход включает разработку планов готовности к засухе, которые координируют политику по оказанию помощи в случае засухи.Например, объединение ресурсов для реагирования на засуху на региональном уровне в странах Африки к югу от Сахары оказалось более рентабельным, чем отдельное финансирование помощи в связи с засухой в отдельной стране (Clarke and Hill 2013 1459 ). Эффективные планы обеспечения готовности к засухе требуют хорошо скоординированных и комплексных действий правительства — ключевой урок, извлеченный в период с 2015 по 2017 год в ходе реагирования на засуху в Кейптауне, Южная Африка (Visser 2018 1460 ). Надежная, актуальная и своевременная информация о климате и погоде помогает надлежащим образом реагировать на засухи (Sivakumar and Ndiang’ui 2007 1461 ).Улучшение знаний и интеграция информации о погоде и климате могут быть достигнуты путем укрепления систем раннего предупреждения о засухе в различных масштабах (Verbist et al. 2016 1463 ). Было обнаружено, что каждый доллар, вложенный в укрепление гидрометеорологических служб и служб раннего предупреждения в развивающихся странах, приносит от 4 до 35 долларов США (Hallegatte 2012 1464 ). Улучшенный доступ и охват страхованием от засухи, включая индексное страхование, могут помочь смягчить воздействие засухи на средства к существованию (Guerrero-Baena et al.2019 1465 ; Kath et al. 2019 1466 ; Осгуд и др. 2018 1467 ; Ruiz et al. 2015 1468 ; Tadesse et al. 2015 1469 ).
Третья категория ответных мер на засуху включает снижение риска засухи. Снижение риска засухи — это комплекс упреждающих мер, политик и управленческих мероприятий, направленных на уменьшение будущего воздействия засухи (Vicente-Serrano et al. 2012 1470 ). Например, политика, направленная на повышение эффективности водопользования в различных секторах экономики, особенно в сельском хозяйстве и промышленности, или общественные информационно-пропагандистские кампании, повышающие осведомленность общества и вызывающие изменение поведения для сокращения расточительного потребления воды в жилищном секторе, относятся к числу таких мер по снижению риска засухи. политики (Цакирис 2017 1471 ).Работа с общественностью и мониторинг инфекционных заболеваний, качества воздуха и воды оказались полезными для снижения воздействия засух на здоровье (Юса и др., 2015 1472 ). Данные, полученные в результате реакции домохозяйств на засуху в Кейптауне, Южная Африка, в период с 2015 по 2017 год, предполагают, что освещение в СМИ и социальные сети могут сыграть решающую роль в изменении поведения потребления воды, даже в большей степени, чем официальные ограничения на потребление воды (Booysen et al. 2019 1473 ). Подходы к снижению риска засухи менее затратны, чем оказание помощи при засухе после наступления засухи.Для иллюстрации Harou et al. (2010) обнаружили, что создание рынков воды в Калифорнии значительно снизило расходы, связанные с засухой. Применение водосберегающих технологий снизило затраты на засуху в Иране на 282 миллиона долларов США (Салами и др., 2009, , 1474, ). Букер и др. (2005) подсчитали, что межрегиональная торговля водой может снизить издержки засухи на 20–30% в бассейне Рио-Гранде, США. Увеличение изменчивости осадков в условиях изменения климата может сделать формы индексного страхования, основанные на осадках, менее эффективными (Kath et al.2019 1475 ). Ряд разнообразных инструментов, касающихся свойств водных ресурсов, включая инструменты, позволяющие осуществлять перекачку воды, вместе с технологической и институциональной способностью регулировать распределение воды могут улучшить своевременную адаптацию к засухе (Hurlbert 2018 1476 ). Управление водными ресурсами со стороны предложения, предусматривающее пропорциональное сокращение подачи воды, препятствует важному варианту адаптации к изменению климата, заключающемуся в управлении водой в соответствии с потребностями или спросом (Hurlbert and Mussetta 2016 1477 ).Исключительное использование рынка воды для управления распределением воды аналогичным образом препятствует признанию права человека на воду во время засухи (Hurlbert 2018 1478 ). Политика, направленная на обеспечение землевладения и расширение доступа к рынкам, сельскохозяйственным консультационным услугам и эффективному климатическому обслуживанию, а также на создание возможностей для занятости вне сельского хозяйства, может способствовать внедрению методов снижения риска засухи (Alam 2015 1479 ; Kusunose и Lybbert 2014 1480 ), повышая устойчивость к изменению климата (Раздел 3.6.3), а также вносит свой вклад в УУЗР (разделы 3.6.3 и 4.8.1 и таблица 5.7).
Чрезмерное бремя финансирования мер по борьбе с засухой на государственные бюджеты уже ведет к смене парадигмы в сторону упреждающего снижения риска засухи вместо мер реагирования на засуху (Verner et al. 2018 1481 ; Wilhite 2016 1482 ). Изменение климата усилит потребность в таких упреждающих подходах к снижению риска засухи. Политика снижения риска засухи, которая уже необходима сейчас, будет еще более актуальной при более высоких уровнях потепления (Jerneck and Olsson 2008 1483 ; McLeman 2013 1484 ; Wilhite et al.2014 1485 ). В целом, существует с высокой степенью уверенности в том, что реагирование на засуху посредством ex post мер по оказанию помощи при засухе менее эффективно по сравнению с ожидаемыми инвестициями в снижение риска засухи, особенно в условиях изменения климата.
Тестирование аритмогенности циклофосфамида с использованием индуцированных человеком кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
Все исследования проводились Национальным институтом здравоохранения в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH No.8023, редакция 1978 г.) и одобрена Комитетом по процедурам временного ухода за животными и исследованиями Центра науки о жизни Московского физико-технического института, протокол № A2-2012-09-02.
Образование фибробластов и перепрограммирование до плюрипотентного состояния, характеристика линий ИПСК и дифференцировка ИПСК в кардиомиоциты
Отвод фибробластов и перепрограммирование до плюрипотентного состояния, характеристика линии ИПСК m34Sk3, дифференциация ИПСК в кардиомиоциты ранее описывалась. и методы в Ref. 14 . Вкратце, дермальные фибробласты, выделенные из биопсии кожи здорового донора, подвергали нуклеофекции с помощью эписомальных векторов, экспрессирующих OCT4 , SOX2 , KLF4 , L-MYC и LIN28 (Addgene IDs # 41855-418 41813-41814). Поверхность для посева клеток была покрыта матрицей мембран базальной мембраны Geltrex без LDEV, сертифицированной hESC с пониженным фактором роста. Перепрограммирование в плюрипотентное состояние было выполнено, как описано в https: //tools.thermofisher.com / content / sfs / manuals / epi5_episomal_ipsc_reprogramming_man.pdf. Спонтанная дифференцировка клеточных линий осуществлялась за счет образования эмбриоидных телец. ИПСК культивировали в течение нескольких пассажей в условиях без кормления. Направленную дифференцировку ИПСК в кардиомиоциты запускали добавлением среды RPMI 1640 (Lonza), содержащей добавку B27 без инсулина (Thermo Fisher Scientific) и 8 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich) на 48 часов. Первые сокращения клеток наблюдались с 9-го дня дифференцировки.Данные проточной цитометрии для кардиальных маркеров CMs, полученных из ИПСК здорового донора, которые использовались в этом исследовании (линия клеток m34Sk3), представлены в ссылке. 15 эффективность направленной дифференцировки ИПСК в кардиомиоциты составила 47%. Дифференцированные клетки подвергали метаболической селекции для выделения кардиомиоцитов, почти все клетки, прошедшие метаболическую селекцию, экспрессировали сердечный тропонин Т на 45 день. Когда культура достигла 50 дней, производилось оптическое картирование.
Подготовка кардиомиоцитов желудочков новорожденных крыс, подготовка образцов
Подготовка NRVM, подготовка образцов выполнялась, как описано ранее в разделе «Материалы и методы» в ссылке. 16 . Вкратце, изоляция и посев NRVM были выполнены в соответствии с протоколом Уортингтона (http://www.worthington-biochem.com/NCIS/default.html). Для посева и культивирования клеток 13- и 21-миллиметровые стеклянные покровы покрывали человеческим фибронектином (Imtek) и помещали в чашки Петри и 24-луночные планшеты для культивирования.ИПСК помещали в лунки 24-луночных стерильных планшетов, покрытых Geltrex. Протокол дифференциации начинался на 3-4 день после посева.
Протокол оптического картирования
Оптическое картирование выполняли, как описано ранее 13,14 . В состав установки входила высокоскоростная видеокамера (Andor IXon3, Andor Technologies), ртутная лампа (Olympus U-RFL-T), оптический микроскоп (Olympus MVX10), фильтрующий куб (Olympus U-M49002XL) и генератор импульсов. (Vellemann, PCGU-1000), платиновый острие и эталонный круглый электрод.
Оптическое картирование кардиомиоцитов, полученных из ИПСК человека, произошло через 50 дней после начала протокола дифференцировки. Образцы инкубировали в стерильной среде при 37 ° C с флуоресцентным кальций-зависимым красителем Fluo-4 AM (Invitrogen, США) в концентрации 4 мкг / мл в течение 30 мин. Затем раствор красителя заменяли стерильным раствором Тирода (Sigma T2145), содержащим 136,9 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl 2 , 1,1 мМ MgCl 2 , 0,4 мМ NaH 2 PO 4 , 11 .9 мМ NaHCO 3 , 5,6 мМ d-глюкоза, pH = 7,4 с концентрацией свободного Ca 2+ 1,80 мМ.
Сначала образцы проверяли на наличие самопроизвольного избиения. Затем инициировали прохождение прямоугольных импульсов частотой 1 Гц. Если ткань захватывала импульсы с частотой 1 Гц, частота прямоугольных импульсов увеличивалась с шагом ≤ 0,5 Гц. На каждом шаге проверялось, улавливаются ли импульсы заданной частоты. Когда ткань не могла улавливать каждый из внешних импульсов (например, захват 1: 2) заданной частоты, значение частоты на предыдущем этапе было MCR.После сбора контролей CV и MCR раствор CP (Baxter) в Tyrode’s добавляли к культуре клеток в концентрациях: 213 мкМ, 639 мкМ, 852 мкМ, 1065 мкМ в порядке возрастания. CV и MCR измеряли ≤ 10 мин после добавления раствора CP. CV измеряли на частоте 1 Гц, для измерений MCR частоту увеличивали с 1 до 5 Гц с шагом ≤ 0,5 Гц. Три независимых дифференцировки клеточной линии m34Sk3 были выполнены с n = 2, n = 3 и n = 3 независимыми сериями экспериментов соответственно.Эксперименты проводились при 37 ° C, 0,03–0,05% CO 2 .
Поскольку метаболизм отдельного организма специфичен, соответствие между концентрациями in vitro и концентрациями в мг / кг можно приблизительно оценить. При массе тела человека 60 кг и объеме крови 4,8 л 213–1065 мкМ CP in vitro соответствуют 4,45–22,25 мг / кг.
Стандартное линейное препятствие
После добавления раствора Тирода к образцу на клеточной ткани было создано стандартное линейное препятствие перпендикулярно направлению распространения волны возбуждения (дополнительный рис.1). Ширина препятствия ≤ 100 мкм. Оценена конфигурация фронта распространяющейся волны при нормальных условиях и при различных (213–852 мкМ) концентрациях ЦП в присутствии стандартного линейного препятствия. Было проведено N = 8 независимых прогонов экспериментов, и подсчитано количество случаев образования повторного входа.
Патч-зажим
Цельные токи клеток регистрировали с использованием метода перфорированного патч-зажима в одиночных кардиомиоцитах, которые были изолированы от соседних клеток.В качестве перфорирующего агента использовали амфотерицин B в ДМСО в конечной концентрации 0,24 мг / мл 17 . Покровное стекло с сердечными клетками помещалось в записывающую камеру, установленную на столике инвертированного микроскопа Olympus IX71. Пипетки и внеклеточные растворы, используемые в этих протоколах, перечислены ниже.
Раствор для купания, используемый для регистрации тока Na + : 50 мМ NaCl, 1,8 мМ CaCl 2 , 1 мМ MgCl 2 , 110 мМ CsCl 2 , 10 мМ d-глюкоза, 10 мМ HEPES / NaOH (pH = 7.4 CsOH). Патч-пипетка была заполнена раствором: 135 мМ CsCl 2 , 10 мМ NaCl, 2 мМ CaCl 2 , 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES / NaOH, 5 мМ MgATP (pH = 7,2 CsOH). Для регистрации тока Ca 2+ : 160 мМ TEA-Cl, 5 мМ CaCl 2 , 1 мМ MgCl 2 , 10 мМ d-глюкоза, 10 мМ HEPES / NaOH (pH = 7,4 CsOH). Раствор пипетки содержал 145 мМ CsCl 2 , 5 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES / NaOH, 5 мМ MgATP (pH = 7,2 CsOH). Для регистрации токов IKr для всей клетки раствор для купания содержал 150 мМ NaCl, 5.4 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2 , 1,8 мМ CaCl 2 , 15 мМ d-глюкоза, 15 мМ HEPES / KOH (pH = 7,4 NaOH) и патч-пипетка была заполнена раствором, содержащим 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2 , 5 мМ NaCl, 5 мМ MgATP, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES / КОН (pH = 7,2 КОН). Нифедипин использовался для блокирования кальциевых каналов 18 .
Эксперименты с фиксацией напряжения были выполнены, как описано ранее в разделе «Материалы и методы» в Ref. 19 . Пипетки-пипетки вытягивали из боросиликатного стекла (BF150-86-10 Sutter Instrument, США) с сопротивлением кончика ~ 3 МОм при помещении в экспериментальный раствор.Смещение пипетки было скорректировано до нуля непосредственно перед формированием гигаомного (ГОм) уплотнения. После образования уплотнения ГОм емкость пипетки была отменена с использованием настроек быстрого подавления емкости усилителя. На электрический доступ к клетке через перфорацию указывало появление медленных емкостных токов, которые увеличивали амплитуду и скорость распада, когда в мембране, закрытой патч-пипеткой, образовывалось больше пор амфотерицина. Сопротивление доступа контролировалось с использованием настроек медленного подавления емкости всей ячейки на усилителе.Как только сопротивление доступа упало ниже 12 МОм, эксперимент был начат. При необходимости было компенсировано последовательное сопротивление.
Целостные токи, вызванные нарастанием стимулов от — 120 до + 50 мВ, исследовали в течение периода 200 мс с удерживающим потенциалом (HP) — 80 мВ (с использованием предварительного шага: от — 80 до — 120 мВ для 100 мс) 20 . Зависимость пикового тока Na + от напряжения была определена путем измерения пикового внутреннего тока для ячеек, деполяризованных от -80 до + 15 мВ с шагом 5 мВ, которые применялись в течение 200 мс.Для обнаружения токов L-типа Ca 2+ без загрязнения токами Na + использовался предымпульс длительностью 100 мс до -40 мВ от -80 мВ 21,22 . Пик ICaL измеряли при 0 мВ. Внешний IKr вызывался 5-секундным деполяризующим импульсом от -40 мВ до + 50 мВ с шагом 10 мВ (HP = -40 мВ). IKr был изолирован как чувствительный к E4031 ток 23 . Обычно емкость мембраны, измеренная с помощью программного обеспечения pCLAMP10.2, составляла от 20 до 50 пФ.
Эксперименты проводились при 37 ° C, 0,03–0,05% CO 2 .
Иммунофлуоресцентное окрашивание
Протокол, используемый для фиксации и иммуноцитохимии образцов, был разработан в соответствии с рекомендациями https://www.abcam.com/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано ранее 13 . Клетки фиксировали в течение 10 минут в 4% параформальдегиде, проницаемость в течение 10 минут в 0,4% Triton-X100.Клетки дополнительно инкубировали в течение 30 мин в блокирующем буфере (1% бычий сывороточный альбумин в фосфатно-солевом буфере, PBS) в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами и в течение 1 ч при комнатной температуре со вторичными антителами. Клетки дважды промывали по 15 мин в PBS. Ядра окрашивали DAPI. Первичные антитела (рабочее разведение — 1: 100) — саркомерный альфа-актинин (Abcam, ab9465). Вторичные антитела (Thermo Fisher Scientific, рабочее разведение — 1: 400) — козьи антимышиные IgG (HþL) Alexa Fluor 568 с высокой перекрестной адсорбцией (A11031).Фаллоидин Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, США, A12379) использовали для неспецифического окрашивания F-актина.
Оценка структурной целостности цитоскелета hiPSC-CMs
Обычно α-актинин в кардиомиоцитах связан с F-актином, который организован в несколько параллельных пучков. Эти конструкции сильно подвержены CP. Степень этого эффекта оценивалась с помощью плагина Fast Fourier Transform and Directionality в ImageJ (NIH, Мэриленд, США, http://rsb.info).nih.gov/ij) программное обеспечение. Это позволило проанализировать распределение ориентации структур, присутствующих на входном изображении.
Параллельные пучки F-актина, поперечно сшитые α-актинином, отображаются на диаграммах распределения как пиковые значения по сравнению с базовой интенсивностью. Повреждение клеточных структур приводит к снижению пиковой интенсивности и увеличению базовой интенсивности. Контраст самого высокого пика был рассчитан в соответствии с определением Вебера 24 как:
$$ {\ text {C}} = ({\ text {Imax}} — {\ text {Ibl}}) / {\ text {Ibl,}} $$
где C обозначает контраст; Imax — максимальная предпочтительная ориентация структур; Ibl — это базовая интенсивность, рассчитанная плагином Directionality.
Обработка данных и статистика
Обработка данных выполнялась, как описано ранее 16 . Все видео с оптического картирования и изображения с конфокального микроскопа обрабатывались в ImageJ. Карты активации были созданы с использованием Wolfram Mathematica. Статистическая значимость определялась с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим наименьшим значимым различием Фишера для сравнений между группами. Статистически значимыми считались значения p <0,05.
% PDF-1.5 % 8 0 объект > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 38 0 объект > эндобдж 39 0 объект > эндобдж 40 0 объект > эндобдж 41 0 объект > эндобдж 42 0 объект > эндобдж 43 0 объект > эндобдж 44 0 объект > эндобдж 45 0 объект > эндобдж 46 0 объект > эндобдж 47 0 объект > эндобдж 48 0 объект > эндобдж 49 0 объект > эндобдж 50 0 объект > эндобдж 51 0 объект > эндобдж 52 0 объект > эндобдж 53 0 объект > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 1 0 объект > эндобдж 81 0 объект > эндобдж 82 0 объект > поток
конечный поток эндобдж 83 0 объект > / PageMode / UseOutlines / Metadata 82 0 R >> эндобдж 84 0 объект > эндобдж 86 0 объект > / XObject> / ExtGState> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / MediaBox [0 0 595.